Summary

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Published: July 12, 2018
doi:

Summary

간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

Abstract

누가 살아남을 폐 렴 환자 병원 방전을 따르는 달에서 사망률 높은 있다. 그것은 폐 렴 중 폐 조직의 감염 이후의 끝 기관 실패를 이끌어 낼 수 있는 오래 된 cytotoxins의 생산에 결과 가설 되었습니다. 생체 외에서 분석 실험 폐 감염 시 cytotoxins 생산 가설 테스트를 개발 했습니다. 고립 된 쥐 폐 동맥 내 피 세포 및 박테리아 녹 농 균 모델 시스템으로 사용 되 고 cytoxins 내 피 세포의 감염 박테리아에 의해 다음의 생산 세포 배양 뒤를 사용 하 여 설명 된다 젖 산 효소 분석 실험 및 ImageJ 기술을 활용 하 여 새로운 미세한 메서드를 사용 하 여 직접 정량. 이러한 cytotoxins의 녹말 체 자연 및 immunoblotting 및 A11 안티 아 밀 로이드 항 체를 사용 하 여 immunodepletion thioflavin T 바인딩 분석 실험에 의해 입증 되었다. Immunoblotting를 사용 하 여 추가 분석 oligomeric 타우와 Aβ 생산 했 고 피 녹 농 균에 의해 감염에 따라 내 피 세포에 의해 발표는 설명 했다. 이러한 방법은 인간의 임상 샘플의 분석에 쉽게 적응할 수 있어야 합니다.

Introduction

폐 렴 생존 하는 환자의 병원 방전1,을 따르는 달에서 사망률 높은2,,34,,56. 대부분의 경우, 죽음은 치기5,6뿐만 아니라 최종 기관 실패 신장, 폐, 심장, 또는 간 이벤트의 어떤 종류에 의해 발생 합니다. 이 환자 인구에 있는 높은 사망 율을 위한 이유는 결코 설립 되었습니다.

폐 렴으로 인수 되 고 중 커뮤니티-분류 또는 병원 인수 (nosocomial), 그리고 폐 렴을 일으킬 수 있는 에이전트 포함 박테리아, 바이러스, 버섯, 그리고 화학 제품. 병원내 폐 렴의 주요 원인 중 하나는 녹 농 균박테리아입니다. P. 농 균 exoenzymes 대상 셀7,8의 세포질에 직접 되 나 다양 한 이펙터 분자 전송 유형 III 분 비 시스템을 사용 하는 그램 음성 유기 체 이다. 폐 내 피 세포의 감염, 동안에 exoenzymes 대상 microtubule 관련 단백질 타우9,,1011,12의 내 피 형태를 포함 하 여 다양 한 세포내 단백질 , 폐 기능 그리고, 때때로, 죽음 감소 심각한 폐 부 증의 결과로 내 피 장벽 붕괴에 지도.

앞에서 설명 했 듯이, 초기 폐 렴을 생존 하는 환자의 병원 방전에 따라 첫 12 개월에 사망률 높은 있다. 이 현상을 설명 하는 잠재적인 메커니즘은 빈약한 장기 결과 리드 초기 감염 시 생성 되는 장 독 소의 일부 형식을. 두 가지 관찰이이 가능성을 지원합니다. 첫째, 교양 폐 내 피 세포 처음 P. 농 균 으로 취급 되는 박테리아는 항생제13에 의해 사망 후 주일 대에 실패 합니다. 둘째, 수명이 긴 prions 및 에이전트 프리온 특성을 가진 다양 한 인간과 동물 질환, 신 경계14,15와 관련 된 질병 특히 입증 되었습니다.

폐 감염 시 수명이 긴 세포 독성 대리인의 잠재적인 생산을 조사 하기 위한 방법 적 설명 했습니다. 일련의 간단한 체 외에서 분석 설명 되어 있습니다 여기 cytotoxin 생산 및 사용 하는 일반적인 폐 렴 원인이 에이전트, P. 녹 농 균감염 다음 활동 조사를 위해 사용할 수 있습니다. 이 분석 실험 조사 가능한 cytotoxin 유도 감염 원인이 폐 렴, 다른 에이전트를 사용 하 여 다음에 쉽게 적응할 수 있어야 하 고 또한 생성 된 supernatants 전체에서 cytotoxins의 효과 조사 하는 데 유용 해야 기관 또는 동물입니다. 마지막으로,는 여기에 설명 된 가능성이 가장 분석 실험 동물 및 인간의 생물 학적 체액 폐 렴 중 cytotoxins의 생산을 위한 테스트에 적응할 수 있을 것입니다.

Protocol

모든 동물 절차 검토 했다 기관 동물 관리 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학에 의해 승인 하 고 모든 연방, 주, 및 현지 규정에 따라 수행 했다. 쥐 폐 microvascular 내 피 세포 (PMVECs)의 기본 문화 폐 생물학의 사우스 알라바 마 대학의 센터에서 셀 문화 핵심 시설에서 얻은 했다. 셀 앞에서 설명한 절차16를 사용 하 여 준비 되었다. 1입니다. 세포 독성 Supernatants의 ?…

Representative Results

간단한 생체 외에서 시험 셀 박테리아 P. 녹 농 균감염의 supernatants에 cytotoxins의 존재에 대 한 분석 결과를 개발 되었습니다. 기본적으로, 감염 된 세포에서 배양 후 세균 또한 4 h 수집, 박테리아의 표면에 뜨는, 문화 살 균 필터에 의해 제거 되 고 살 균 상쾌한 셀의 새로운 인구에 추가 됩니다. 셀은 다음 상쾌한의 추가 후에 21-24 h를 관찰 하 고 셀 죽이 정량….

Discussion

여기 방법 간단한 체 외에 유기 체를 일으키는 폐 렴으로 감염 시 세포 독성 amyloids의 세대의 데모를 허용 하는 설명 되어 있습니다. 이러한 방법에는 세포 배양 세포 독성 분석 실험, immunoblotting, 소설 현미경 방법 및 ThT 바인딩을 사용 하 여 죽이 세포의 정량 포함 됩니다. 그들은 자연 (그림 2 그림 4)에서 아 밀 로이드 이며 전시 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 NIH 교부 금 HL66299 TS, RB, 및 SL, TS에 HL60024 및 HL136869 mf에 의해 부품에 투자 되었다.

Materials

Rabbit anti beta amyloid Thermo 71-5800
A11 amyloid oligomer antibody StressMarq SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody EMD Millipore ABN454
Thioflavin T Sigma Aldrich T3516
HBSS Gibco 14025-092
PBS Gibco 10010-023
0.22 micron syringe filters Millipore SLGP033RS
DMEM Gibco 11965-092
HRP Goat antirabbit IgG Abcam ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin Sigma Aldrich L9381
TRITC Helix pomatia lectin Sigma Aldrich L1261
Agar Fisher BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose BioRad 162-0112
Type 2 collagenase Worthington LS004176
Fetal bovine serum Hyclone SH30898.03IH
PenStrep Gibco 15070063
Carbenicillin Disodium salt Sigma  C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off Millipore UFC801008
Potassium phosphate dibasic Sigma  795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate MP Biomedicals MP021914221
Citric Acid G Biosciences 50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma S9506-500G
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10277

References

  1. Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man’s friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
  2. Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
  3. Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
  4. Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
  5. Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
  6. Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
  7. Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
  8. Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
  9. Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
  10. Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
  11. Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
  12. Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
  13. Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
  14. Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
  15. Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
  16. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
  17. Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).

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Balczon, R., Francis, M., Leavesley, S., Stevens, T. Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (137), e57447, doi:10.3791/57447 (2018).

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