Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa
Summary
Einfache Methoden sind für den Nachweis der Produktion von zytotoxischen amyloide nach Infektion der Lunge Endothel von Pseudomonas Aeruginosabeschrieben.
Abstract
Patienten, die überleben, Lungenentzündung erhöht Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus entlassen. Es ist vermutet worden, dass Infektion des Lungen-Gewebes während der Lungenentzündung führt bei der Herstellung von langlebigen ZELLGIFTE, die nachfolgende Ende Organversagen führen kann. Wir haben in-vitro- Tests um die Hypothese zu testen, während pulmonale Infektion entstehen ZELLGIFTE entwickelt. Isolierte Ratte pulmonalen Endothelzellen und das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa dienen als Modellsysteme und die Produktion von Cytoxins nach Infektion der Endothelzellen durch Bakterien zeigt mit Zellkulturen, gefolgt von direkte Quantifizierung mit Laktat-Dehydrogenase Assays und eine neuartige mikroskopische Methode ImageJ-Technologie. Amyloid Artder diese ZELLGIFTE wurde durch Thioflavin T Bindung Assays und Immunoblotting und Immunodepletion mit A11 Anti-Amyloid Antikörper nachgewiesen. Weitere Analysen mittels Immunoblotting nachgewiesen, dass Oligomere Tau und Aβ wurden produziert und veröffentlicht von Endothelzellen nach Infektion durch p. Aeruginosa. Diese Methoden sollten leicht anpassbar an Analysen der menschlichen klinischen Proben sein.
Introduction
Patienten, die eine Lungenentzündung zu überleben haben erhöhte Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus Entlastung1,2,3,4,5,6. In den meisten Fällen tritt der Tod durch irgendeine Art von Ende-Organversagen einschließlich Nieren-, Lungen-, Herz-, oder Leber Veranstaltungen sowie Schlaganfall5,6. Der Grund für die erhöhte Sterblichkeit bei dieser Patientengruppe wurde nie eingerichtet.
Als wird entweder ambulant erworbener Pneumonie eingestuft oder nosokomiale (nosokomiale) und Agenten, die Pneumonie verursachen können auch Bakterien, Viren, Pilze und Chemikalien. Eine der wichtigsten Ursachen der nosokomialen Pneumonie ist das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa. P. Aeruginosa ist ein gramnegatives Organismus, der eine Typ-III-Sekretion-System verwendet, um verschiedene Effektor-Molekülen, genannt Exoenzymes, direkt in das Zytoplasma der Ziel-Zellen7,8übertragen. Während der Infektion von pulmonalen endothelial Zellen gezielt die Exoenzymes verschiedene intrazelluläre Proteine, einschließlich eine endotheliale Form der Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau9,10,11,12 , was zu endotheliale Barriere Aufschlüsselung, was zu schweren Lungenödem, verringerte Lungenfunktion und oft zum Tod.
Wie bereits erwähnt, haben Patienten, die überleben die ersten Lungenentzündung Sterberaten in den ersten 12 Monaten nach Krankenhaus entlassen erhöht. Ein möglicher Mechanismus für die Erklärung dieses Phänomens ist, dass irgendeine Art von langlebigen Toxin während der anfänglichen Infektion entsteht, die schlechte Langzeitprognose führt. Zwei Beobachtungen unterstützen diese Möglichkeit. Erste, kultivierte pulmonale Endothelzellen, die ursprünglich mit p. Aeruginosa behandelt werden nicht für vermehren sich bis zu einer Woche nach der Bakterien durch Antibiotika13getötet werden. Zweite, langlebigen Prionen und Agenten mit Prion Eigenschaften wurden in verschiedene Krankheiten bei Mensch und Tier, insbesondere Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Nervensystem14,15nachgewiesen.
Methoden für die Prüfung der möglichen Produktion von langlebigen Zytostatika in pulmonale Infektion sind nie beschrieben worden. Hier werden eine Reihe von einfachen in-vitro- Tests beschrieben, die für die Untersuchung von Zytotoxin Produktion und Aktivität nach Infektion mit einem gemeinsamen Lungenentzündung verursachen Mittel, p. Aeruginosaverwendet werden. Diese Tests sollten leicht anpassungsfähig zu untersuchen mögliche Zytotoxin Induktion nach Infektion mit anderen Agenten, die Pneumonie verursachen, und die Überstände, die generiert werden sollte auch für die Untersuchung von Auswirkungen der ZELLGIFTE ganz nützlich sein Organe oder Tiere. Schließlich werden die Assays, die hier, am ehesten beschrieben werden anpassungsfähig, tierische und menschliche biologische Flüssigkeiten zur Herstellung von Zellgiften während einer Lungenentzündung zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier werden einfache in-vitro- Methoden beschrieben, die Demonstration der Generation von zytotoxischen amyloiden während der Infektion mit einer Lungenentzündung verursachen Organismus erlauben. Diese Methoden umfassen eine Zelle Kultur Zytotoxizität Assay, Immunoblotting, Quantifizierung der Zelle Tötung mit ein neues mikroskopische Verfahren und ThT Bindung. Analysen der Zytostatika haben gezeigt, dass sie Amyloid in der Natur (Abbildung 2 und <strong class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde in Teilen von NIH-Stipendien HL66299 TS, RB und SL, HL60024, TS und HL136869 MF finanziert.
Materials
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man’s friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
