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Immunology and Infection

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

Published: June 14, 2018
doi:
10.3791/57421
, , , , ,
1Immunobiology of Dendritic Cells,Institut Pasteur, 2INSERM U1223, 3Laboratory of Neurogenetics and Neuroinflammation, INSERM UMR1163,Institut Imagine, 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine,University of Edinburgh, 5Manchester Centre for Genomic Medicine,University of Manchester

Summary

Aquí presentamos un protocolo para describir el desarrollo y validación de un sola molécula matriz digital ensayo ELISA, que permite la detección ultrasensible de todos los subtipos de IFN-α en muestras humanas.

Abstract

El objetivo principal de este protocolo es describir el desarrollo y validación de interferón (IFN)-ensayo de ensayo genitals del ImmunoSorbent (ELISA) digital de matriz α sola molécula. Este sistema permite la cuantificación de la proteína IFN-α humana con sensibilidad sin precedentes y con ninguna reactividad cruzada para otras especies de IFN.

El primer paso clave del protocolo es la elección de la pareja de anticuerpo, seguida por la conjugación del anticuerpo de captura de bolas paramagnéticas y biotinylation del anticuerpo de detección. Tras este paso, diferentes parámetros tales como la configuración de análisis, concentración de anticuerpo detector y tampón composición pueden modificarse hasta logra una sensibilidad óptima. Por último, especificidad y reproducibilidad del método son evaluados para asegurar la confianza en los resultados. Aquí, hemos desarrollado un ensayo de arreglo sola molécula de IFN-α con un límite de detección de fg/mL 0,69 con autoanticuerpos de alta afinidad aislados de pacientes con mutaciones biallelic en la proteína del regulador autoinmune (AIRE) provocando polyendocrinopathy autoinmune síndrome tipo 1 autoinmune distrofia polyendocrinopathy-candidiasis-ectodérmica (APS1/APECED). Lo importante, estos anticuerpos permitieron la detección de los 13 subtipos de IFN-α.

Esta nueva metodología permite la detección y cuantificación de la proteína IFN-α en muestras biológicas humanas a concentraciones de attomolar por primera vez. Esta herramienta será muy útil en el seguimiento de los niveles de esta citoquina en la salud y la enfermedad, la mayoría especialmente infección, autoinmunidad y autoinflammation.

Introduction

Tipo I IFNs son una familia de citoquinas que juegan un papel central en la orquestación de la respuesta inmune antiviral. Fueron primero descubiertos por Isaacs y Lindenmann 60 años1,2 y que ahora se conoce que esta heterogénea familia de polipéptidos cuenta con 14 diferentes subclases (13 subtipos de IFN-α y IFN-1 β). Tipo I IFNs son esenciales para la separación de las infecciones virales, pero también han sido implicados en la patología de una variedad de Estados de enfermedad humana, incluyendo las enfermedades autoinmunes lupus eritematoso sistémico (les), dermatomyositis juvenil (JDM), y el tipo Me interferonopathies en el tipo constitutivo que IFN-inducido señalización resultados en patología3,4,5,6,7.

Estudiando la proteína IFN de tipo I niveles en muestras biológicas ha sido difícil desde su identificación inicial como una “injerencia en sustancia”1,2. En la actualidad, sándwich de ensayo genitals del ImmunoSorbent (ELISA) es el método más ampliamente utilizado para la detección de la proteína IFN-α. A pesar de ser específico, simple y rápido, tipo I IFN ELISA presentan limitaciones importantes, tales como limitada sensibilidad. Además, la medida de todos los subtipos de IFN-α requiere el uso de múltiples ensayos con su propia sensibilidad y capacidad de detección. Si bien hay ELISAs comerciales que detectan diferentes subtipos de IFN-α, su sensibilidad es limitada (1.95 pg/mL, 12,5 pg/mL y 12,5 pg/mL, respectivamente) que a menudo es insuficiente para detectar la proteína IFN-α en muestras biológicas. Para superar esta limitación, varios proxy biológica se han desarrollado ensayos para cuantificar tipo I IFN por medir la expresión génica inducida o actividad funcional8,9,10,11, 12 , 13 , 14. sin embargo, estos ensayos no proporcionan una medida directa de la proteína IFN-α.

En este estudio, a la sola molécula matriz digital ELISA tecnología se utilizó para desarrollar un análisis para la detección de moléculas individuales de proteínas IFN-α. ELISA digital utiliza la misma química básica como ELISA convencional, sin embargo, la reacción ocurre en arreglos de discos que comprende1646 femtoliter tamaño de la pozos de la individual 50.000 de la15,. Las moléculas de proteína solo son capturadas por perlas paramagnéticas recubiertas de anticuerpo y marcadas con un anticuerpo de detección biotinilado, seguido por Unión de una enzima conjugado, estreptavidina-β-galactosidasa (SBG). Posteriormente, los granos se suspenden con un sustrato de enzima fluorógenos, resorufin-β-D-galactopiranosida (RGP), en arreglos de discos de una sola molécula. Disminuyendo el volumen se logra la reacción de 2 mil millones de veces17, una alta concentración local de la señal fluorescente y cuentas sola molécula ser factibles, ya que cada molécula genera una señal de que ahora puede ser confiablemente medición18. En esencia las matrices sola molécula son capaces de contar solo immunocomplexes y determinar un promedio de enzimas por grano (AEB). Contando los pocillos en los que se detecta una señal permite cuantificación/digitalización de moléculas de proteína, ya que existe una correlación directa entre la concentración de la proteína y la relación entre granos de immunocomplexed y un número total de granos presentes en las cámaras de tamaño femtoliter.

Yeung et al. realizó un estudio de evaluación de plataforma cruzada extensa con nueve diferentes tecnologías y cuatro inmunoensayos de la citoquina con el objetivo de comparar análisis precisión, sensibilidad y correlación de datos entre diferentes plataformas19. Uno de los hallazgos claves del estudio fue que sola molécula matrices y sola molécula contando inmunoensayo presentaron la más alta sensibilidad para la detección de citocinas en suero humano dentro de la gama de concentración sub-pg/mL. Sola molécula matriz digital ELISA citocinas los ensayos se han utilizado para estudiar el papel de TNF-α e IL-6 en el Crohn enfermedad20, IFN-α en interferonopathy y autoinmunes pacientes 7, y los diferentes postraduccional modificación formas del C-X-C motivo chemokine 10 (CXCL10) en la hepatitis crónica y en donantes sanos recibiendo sitagliptina21,22. Otras aplicaciones incluyen la medición de la rodopsina en pacientes con retinopatía diabética23; el estudio de patologías del cerebro a través de las mediciones de suero o plasma del neurofilament luz24 y β amiloide 1-42 péptido25, en el contexto de la esclerosis múltiple y enfermedad de Alzheimer, respectivamente. Sola molécula matriz ensayos también pueden utilizarse para detección de patógenos mejoradas tales como caracterización del reservorio viral VIH26y también para la detección de ADN27 y micro RNAs28. Una gran ventaja de la tecnología de matriz de molécula única es esta gran versatilidad, como un ensayo contra cualquier analito de interés se puede desarrollar si se dispone de un par de anticuerpos específicos. Además, kits de ensayo de homebrew están disponibles comercialmente, permitiendo el desarrollo de nuevos ensayos, el protocolo que se detalla en el formulario modificado.

Aquí, una descripción detallada de los pasos de desarrollo y validación de un ensayo de arreglo sola molécula se presenta que resulta en mayor sensibilidad para la detección de la proteína IFN-α. Anticuerpos contra la molécula única matriz ensayos debe ser altamente específico, evitando reactividad cruzada con proteínas relacionadas (con especificidad de especie considerada si es relevante). Idealmente, deben elegirse de anticuerpos con una KD menor que 10-9 M; alta afinidad asegura atascamiento fuerte, con la producción de una señal mayor. La cinética de la Unión antígeno-anticuerpo son también importantes y rápida Ken y K lentoapagado favorecerá Asamblea complejo antígeno-anticuerpo. A partir de un par de anticuerpo que tiene un buen rendimiento en ELISA clásica, con un límite de detección (LOD) de 1-100 pg/mL, aumenta las posibilidades de obtener un análisis de matriz muy sensible a la sola molécula. Chang y sus colegas realizaron estudios cinéticos detallados de las interacciones biomoleculares que ocurren en cada paso, proponiendo un conjunto de ecuaciones para predecir la sensibilidad analítica18. Demostraron esa matriz sola molécula ELISA digital parece ser eficaz en una amplia gama de afinidades de anticuerpo (KD ~ 10−11 – 10−9 M), así como la generación de esa señal es más dependiente de la tasa de estos anticuerpos.

Para utilizar afinidad alta tomamos ventaja de los anticuerpos aislados de pacientes con el síndrome polyendocrinopathy autoinmune los anticuerpos tipo distrofia polyendocrinopathy-candidiasis-ectodérmica autoinmune 1 (APS1/APECED)29. Por razones que todavía no se entienden, la gran mayoría de las personas deficientes en AIRE desarrolla un conjunto básico de anticuerpos de alta avidez contra todos los subtipos de IFN-α29, y se seleccionaron dos clones de anticuerpos anti-IFN-α de las afinidades de enlace complementario para los diferentes subtipos de IFN-α, según la estimación de valores de IC50 . La combinación de estos anticuerpos de alta afinidad únicas con tecnología de matriz de molécula única permitió la cuantificación directa de IFN-α en las concentraciones de attomolar (fg/mL). Tal detección ultrasensible de la proteína IFN-α contribuye a una mejor comprensión de la naturaleza, la regulación y el impacto biológico de la respuesta de IFN-inducido en entornos diferentes de la enfermedad.

Protocol

1. selección de anticuerpos Antes de comenzar el protocolo de revisar todos los pasos claves (tabla 1) y seleccionar anticuerpos óptimo.Nota: Este protocolo se seleccionaron anticuerpos de alta afinidad anti-IFN-α – la IC50 de los cuales se describen en la tabla 2 . Preferentemente, elija una pareja que funciona bien con ELISA convencional. 2. conjugación del anticuerpo de captura a bolas paramagnéticas y ensayo de diferentes concentraciones Nota: Mantenga siempre grano verbal de búfer (BCB) y grano lavado tampón (BWB) sobre el hielo durante el proceso de conjugación del anticuerpo. Cambio de tampón de anticuerpo de captura Tome la cantidad inicial de anticuerpos anti-IFN-α A prueba 3 ratios de conjugaciones de diferente grano (0,038 mg/mL, 0,075 mg/mL y 0,3 mg/mL).Nota: Concentraciones de anticuerpos bajo la capa pueden ser beneficiosas si el ensayo presenta una señal de euforia. Cantidad de anticuerpos inicial debe registrar una pérdida estimada de 30% durante el proceso de cambio de buffer. Según instrucciones del fabricante y con el fin de reducir el fondo inicial, se probaron concentraciones de 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL y 0,3 mg/mL, aunque a menudo no se obtuvieron estos valores exactos debido a la pérdida variable mencionada en el búfer de proceso de intercambio. Añadir el volumen necesario de anticuerpos en una columna del filtro junto con el BCB, hasta 500 μl. Centrifugue las columnas > 10.000 x g durante 5 min y descarte el flujo a través. Lavar la columna dos veces mediante la adición de un volumen total de 450 μl de BCB seguido por centrifugación a > 10.000 x g durante 5 min y descarte el flujo a través. Coloque la columna de filtro que contiene el anticuerpo en un tubo de microcentrífuga limpio boca abajo – la parte abierta de la columna hacia el interior del tubo nuevo – y centrifugue a 800 x g durante 1 minuto.Nota: Este paso permitirá que colección del anticuerpo limpio. Adición de buffer no es necesaria para este paso. Lavar las membranas con el BCB de 50 μl y centrifugar a 800 x g durante 1 min como en 2.1.5. Medir la concentración de anticuerpos usando un espectrofotómetro de bajo volumen. Añadir el BCB para lograr la concentración del anticuerpo deseado y tenga en cuenta el volumen final.Nota: Se utilizará un volumen de 200 μL para describir el resto del Protocolo, este volumen se denomina 2 volumen (2V). Los siguientes volúmenes de reactivo se adaptará en consecuencia. Mezclar y mantener en hielo. Preparación de grano paramagnético Transferencia de 2.8 x 108 granos (100 μl = 1V) en un tubo de microcentrífuga.Nota: El volumen de los granos es dependiente en el volumen final obtenido en 2.1.8. Vuelta del pulso puso en un separador magnético durante 1 minuto, desechar el diluyente y retire del imán. Añadir 2V de BWB y de vortex durante 5 s. Repita 2.2.2 y 2.2.3 dos veces con BWB y dos veces más con el BCB. 1V de granos añadir 190 μl BCB, agitarlos durante 5 s, vuelta del pulso y almacenar los granos lavados en el hielo. Activación de cuentas Añadir 1 mL de BCB frío a un vial de 10 mg de clorhidrato de 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC) y de vortex hasta que la solución es homogénea. Para 1V de granos añadir 10 μl de EDC diluido frío a los granos lavados, vortex y mantenga en una coctelera a 1.000 rpm durante 30 min a temperatura ambiente.Nota: Preparación de EDC y además de los granos debe realizarse lo antes posible debido a la inestabilidad de la EDC en soluciones acuosas. También, como EDC es altamente reactiva, es importante tener una suspensión homogénea del grano antes de la adición de la EDC con el fin de evitar la activación de grano heterogéneo. Después de la adición de la EDC, los granos deben mantenerse en suspensión. Conjugación de grano de los anticuerpos Vórtice y pulso spin las cuentas activadas. Ahora poner los granos en un separador magnético durante 1 minuto, desechar el sobrenadante del BCB y retire el tubo del imán. Lavar los granos con 2V de BCB. Vortex, vuelta del pulso y en el separador magnético durante 1 minuto. Luego desechar el tampón de BCB y retire los granos del imán. Agregar rápidamente el frío, intercambiado buffer 200 μl (2V) de anticuerpos a las cuentas activadas. Mezclar y mantener durante 2 h en agitador a temperatura ambiente. Bloqueo y Final limpiar del grano Pulso spin la suspensión de los granos recubiertos de anticuerpos, poner en el separador magnético durante 1 minuto, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y medir la concentración con un espectrofotómetro de bajo volumen.Nota: Este paso proporcionará información sobre si los granos están saturados – los valores por encima de cero indica saturación del grano – como detección de anticuerpo soluble no puede enlazar a los granos será medible. Quite los granos conjugados del imán, añadir 2V de BWB, vórtice de 5 s, vuelta del pulso y puesto en el separador magnético durante 1 minuto. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y medir la concentración usando un espectrofotómetro de bajo volumen.Nota: Este paso será proporcionar información sobre si los anticuerpos se fijan estable a los granos. Concentración de anticuerpos detectables en este sobrenadante indica la separación del anticuerpo de los granos, que sucede regularmente. Este análisis a menudo funciona incluso cuando permanecen adheridos a los granos de muy pequeñas cantidades de anticuerpo de captura. Quite los granos conjugados del imán, añadir 2V de BWB, vórtice de 5 s, vuelta del pulso y puesto en el separador magnético durante 1 minuto. Quitar granos conjugados del imán, añadir 2V de tampón de bloqueo de grano, vortex durante 5 s e incubar en agitador durante 30 min a temperatura ambiente. Lavado recubiertos de anticuerpos y bloqueado cuentas de 3 x con 2V, una vez con BWS y x 2 con tampón de grano (descartar los sobrenadantes). Almacenar los granos recubiertos y bloqueados a 4° C hasta su uso con 2V de tampón de grano.Nota: Justo antes del uso, los granos se deben lavar una vez con Detector/diluyente de muestra utilizando un volumen de 250 x volumen de grano/20, utilizando el separador magnético. 3. detección anticuerpo Biotinilación Detección anticuerpos Buffer intercambio Tomar 260 μg de los dos clones de Ab anti-IFN-α.Nota: Esto toma en consideración una pérdida de 30% durante el cambio de buffer y permite la prueba de dos proporciones diferentes anticuerpos biotina. Proceder como 2.1 mediante Biotinilación reacción tampón (BRB) en lugar de BCB. Medir el volumen y las concentraciones de anticuerpo y ajustar el volumen para obtener una concentración final de 1 mg/mL.Nota: Se trata de una concentración inicial sugerida, pero puede ser optimizada si el ensayo no alcanzar la sensibilidad requerida. Detección anticuerpos Biotinilación Poner el N-hydroxysuccinimide-polietileno-glycol4-biotina (NHS-PEG4-biotina) a temperatura ambiente y agite con un total de 400 μL de agua destilada para lograr una concentración de 3,4 mM. Decidir la proporción de biotina: anticuerpo para probar y mezclar el anticuerpo de detección y biotina diluida en consecuencia (relación 60: 1 equivale a 100 μl de anticuerpo de detección y 4.5 μl de biotina).Nota: Para empezar, pruebe relación 30: 1 y 60: 1. Mezcla de vórtice la biotina anticuerpo, pulso spin e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.Nota: No hay necesidad de agitar. Purificación del anticuerpo de detección biotinilado El anticuerpo biotinilado de transferencia a un filtro nuevo y proceda como 2.1, 3 pasos de lavado con BRB (400, 450 y 450 μL) y una colección final. Medir el volumen y la concentración de la purificada, anticuerpo de detección biotinilado y conservar a 4 ° C hasta su uso. 4. optimización del análisis Nota: Utilizar el software de analizador de matriz sola molécula en una configuración de Homebrew30.La sola molécula matriz analizador máquina es controlada por software que permite para ejecutar estandardizaciones análisis, realizar cuantificaciones de la muestra, para modificar los parámetros externos (grano, detector, SBG, RGP concentraciones, diluciones de muestra…) e internos parámetros (número de pasos, tiempos de incubación…) para lograr las condiciones óptimas de ensayo y también puede utilizarse para calcular los resultados (cantidades de fondo, LOD,). Para la configuración del analizador de matriz sola molécula y para calcular los volúmenes de reactivo requeridos para cada ronda de optimización, consulte las instrucciones del fabricante. Llevar a cabo las primeras rondas de optimización utilizando una configuración de 2 pasos. Prueba combinaciones de captura cuentas de conjugado de anticuerpos y anticuerpo de detección biotinilado en ambas configuraciones. Prueba combinaciones de los tres A diferentes del anti-IFN-α captura las concentraciones de anticuerpos con los dos diversos anti-IFN-α B Biotinilación cocientes como anticuerpos de detección y captura y vice versa (figura 1) por la selección de las condiciones adecuadas en el software analizador. Elegir la combinación más sensible, es decir, las condiciones que ofrecen la menor LOD, y utilizarlo para nuevas medidasNota: La figura 1 muestra cómo un 0,3 mg/mL anti-IFN-α una concentración de grano de anticuerpo y una relación de biotina: anticuerpo de 30: 1 con el anticuerpo de anti-IFN-α B dio lugar a la sensibilidad más alta, según lo evidenciado por un LOD de 11.6 fg/mL. (Véase complementario tabla 1). Esta combinación se utilizará para todos los pasos futuros. Tenga en cuenta que la gran sensibilidad alcanzado este análisis particular antes de cualquier rondas de optimización. Figura 1: selección de la orientación del anticuerpo, captura la concentración de anticuerpos en los granos y el cociente de Biotinilación. Las dos posibles configuraciones diferentes fueron probadas, con el anti-IFN-α como anticuerpo de captura y B anti-IFN-α como detección anticuerpo (A) y vice versa (B). IFNα – 2C se utilizó como antígeno. Las concentraciones de anticuerpo de captura diferentes así como ratios de biotina: anticuerpo (B:A) también fueron probadas para ambas configuraciones. Línea de puntos muestra LOD para las mejores condiciones; anti-IFN-α A 0,3 mg/mL como captura y anti-IFN-α B biotina: detector anticuerpo relación entre 30 (LOD = 11.6 mg/mL correspondiente a un valor AEB de 0.017265). Se utilizó una configuración de 2 pasos. Biotina: anticuerpo (B:A). haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Comparar un 2 vs. configuración del paso 3.Nota: En una configuración de 3 pasos, hay pasos de incubación diferentes tres, uno con el anticuerpo de captura, una con el anticuerpo de detección y una tercera final para el etiquetado de enzima SBG. Sin embargo, en una configuración de 2 pasos, captura y anticuerpos de detección se incuban al mismo tiempo con el analito de interés. Ejecutar el analizador de matriz sola molécula con la captura y concentración de anticuerpo detector y ratios de 4.1.2 seleccionar las configuraciones de 2 y 3 pasos configuradas previamente en el analizador, instrucciones30 de siguiente fabricante. Elegir la configuración que permite la máxima sensibilidad y guárdela para futuras medidasNota: Como se muestra en la figura 2 y tabla 2 suplementaria, la configuración de 2 pasos dio ligeramente mayor sensibilidad y relación señal/fondo para cada concentración probada. Por lo tanto, la configuración del paso 2 se mantuvo para los pasos futuros. Comparación de 3 pasos configuración Figura 2:2 vs. Se evaluaron las configuraciones de 2 y 3 pasos con 0,3 mg/mL de anti-IFN-α un anticuerpo como captura y B anti-IFN-α como anticuerpo de detección en una proporción de 30 biotina: anticuerpo. IFNα – 2C se utilizó como antígeno. En un ajuste de condición de paso de 3, hay tres incubación diferentes pasos, uno con el anticuerpo de captura, una con el anticuerpo de detección y una tercera final para el etiquetado de enzima SBG. Sin embargo, en una configuración de 2 pasos, captura y anticuerpos de detección se incuban al mismo tiempo con el analito de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Optimización de la concentración de anticuerpo detector y SBG Prueba tres diferentes concentraciones de anticuerpo detector (0.1, 0.3 y 0.6 μg/mL) junto con tres diferentes concentraciones de SBG (50, 150 y 250 pM) como se describe arriba30. Elegir la concentración que da la sensibilidad más alta y para futuros pasos.Nota: La figura 3 muestra que detector de 0.3 μg/mL y SBG 150 pM eran las condiciones que mostró el LOD óptima. Estas condiciones también dieron niveles de fondo baja y mediana amplitud, un comportamiento que produce valores de buena desviación estándar (SD) (complementario tabla 3). Concentraciones típicas oscilan entre 0.1 – 1 μg/mL para el anticuerpo de detección y 50-200 pM de SBG, aunque concentraciones más altas (por ejemplo, hasta 300 pM) de este último puede ser necesario. Es importante evitar las condiciones que se puede representar fondos superiores a 0.02 AEB. Aumento de la concentración del detector anticuerpo monoclonal (mAb) o SBG mejorará la señal respuesta y fondo. Sin embargo, si el incremento en la señal supera el cambio de fondo, mejorará el LOD. Puede surgir una situación en que una disminución de fondo permite mejor discriminación entre calibradores baja. Figura 3: Detector y SBG optimización concentración. Tres diferentes concentraciones de anticuerpo detector de biotinilado (0.1, 0.3 y 0.6 μg/ml) junto con tres diferentes concentraciones de SBG (50, 150 y 250 pM) fueron evaluados. Línea de puntos muestra LOD para las mejores condiciones; anticuerpo detector de 0,3 mg/mL y SBG 150 pM (LOD = 0,09 mg/mL correspondiente a un valor AEB de 0.017184). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Pasos de optimización adicional Si no se ha logrado la sensibilidad requerida, tiempos de incubación diferentes para las distintas etapas mediante las opciones preconfiguradas en el software del analizador de prueba. Si el ensayo no es sensibilidad suficiente, optimizar el número de granos por ensayo mediante las opciones preconfiguradas en el software del analizador.Nota: Una vez pruebas de muestras biológicas, volumen de la muestra es un parámetro adicional susceptible de optimización. Asegúrese de que las muestras se procesan según los procedimientos de seguridad y salud. 5. Análisis de especificidad y reproducibilidad Prueba de especificidad de la prueba del IFN-α, por pruebas de ensayo con diferentes subtipos de IFN-α y otras proteínas relacionadas (figura 4a y 4b). Figura 4: especificidad y sensibilidad de la prueba de conjunto optimizada de IFNα sola molécula. (A) IFN-β, IFN-λ1, λ2 IFN, IFN-ω y proteínas recombinantes fueron probadas, junto con (B) 16 subtipos de IFN-α, IFN-γ incluyendo tres tipos de IFN α2 (α2a IFN IFN-α2b y α2c IFN). Adaptado de Rodero et al. 2017. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Evaluar la reproducibilidad del ensayo optimizado por realizar tres experimentos de replicación independiente y la evaluación de la variabilidad inter-ensayo (figura 5). Calcular el LOD del ensayoNota: El LOD se calculó la media de los tres espacios en blanco + 3 desviaciones estándar (SD), obteniendo así un valor de 0.23 fg/mL. Como el factor de dilución de la muestra estándar es 1:3, la inclusión del factor de dilución da un LOD de 0.69 fg/mL. Figura 5: reproducibilidad del análisis optimizado pan-IFN-α sola molécula matriz. Se realizaron tres carreras independientes usando dos lotes diferentes de granos. Para el segundo lote, se realizaron dos experimentos independientes. Cada medición fue adquirida por duplicado. La línea punteada representa el LOD, definido por la enzima media en blanco media por grano + SD de todas las ejecuciones. IFN-α17 fue utilizado como referencia, teniendo en cuenta que la curva estándar derivada es representante de todos los otros subtipos de IFN-α, como se muestra en la Figura 4b. Muestra valor promedio y SD (barras de error). Las líneas punteadas muestran LOD para las diferentes carreras; Ejecutar 1: 0.073 fg/mL AEB = 0.006238, ejecutar 2: 0.113 fg/mL AEB = 0.007119, ejecutar 3: 0.043 fg/mL AEB = 0.05518). Adaptado de Rodero et al. 2017. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. proteína concurso ensayo Realizar un análisis de la competencia de proteínas (descrito en la leyenda de la figura 6 ) para demostrar aún más la especificidad del ensayo.Nota: Las muestras de Plasma de de los pacientes con les (n = 5) fueron utilizados. Cuando se sospechan de virus presente en la muestra biológica, preparar buffer de inactivación mediante la adición de 200 μL de un surfactante no-ioinic (0,5% nonidet P40 sustituto) a 40 mL Detector muestra diluyente y agitar vigorosamente. Centrifugue las muestras biológicas que contienen el analito de interés a 10.000 g durante 15 min a 4 ° C para eliminar los desechos celulares. Mezcla 185 μl Detector/diluyente o inactivación tampón con 100 μl de muestra biológica (factor de dilución final 3) y el anticuerpo de anti-IFN-α de 15 μl A (inicial de concentración 1 mg/mL, concentración final 50 ug/mL) o buffer. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Ejecutar ejemplos con y sin anticuerpos anti-IFN-α en el analizador de la matriz de la sola molécula como se describió anteriormente.Nota: En caso de saturación de la señal, las muestras deben diluirse. Además, 300 μL es el volumen requerido para el análisis de duplicados. Figura 6: Análisis de proteína competencia. Se realizaron experimentos de competición usando muestras de cinco diversos pacientes de SLE. Las muestras biológicas se centrifugaron a 10,000 g durante 15 min a 4 ° C. Se diluyeron 1/3 con diluyente de muestra Detector que contiene NP40 para inactivación viral. 15µl de anticuerpos anti-IFN-α A (inicial de concentración 1 mg/mL, concentración final 50 μg/mL) o buffer fueron agregados para un volumen total de 300 μl. incubación se realizó a temperatura ambiente por 30 min grupo de Control se muestra en gris y las muestras trataron con anti-IFN-α A anticuerpos aparecen en negro. Gráfico muestra la media y SD (barras de error). Línea punteada representa el LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Adaptado de Rodero et al 2017 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

En Resumen, un análisis de matriz de molécula única pan-IFN-α con un límite de detección de 0.69 fg/mL, con una configuración de 2 pasos de captura cuentas recubierta de 0,3 mg/mL de anti-IFN-α un anticuerpo y anti-IFN-α B detección anticuerpo biotinilado en una proporción de biotina: anticuerpo de 30 fue desarrollado. Las concentraciones para anticuerpo de detección biotinilado y SBG fueron 0.3 μg/mL y 150 pM, respectivamente. Este ensayo altamente específico es capaz de detectar todos los 13 subtipos de IFN-α y Cruz no reacciona con otro tipo de IFN. Así, si bien no es posible identificar y cuantificar cada especie individual de IFN-α, todos ellos pueden ser detectadas y medición da un valor total de la concentración de IFN-α, que comprende las subclases diferentes 13. Para explorar el posible valor diagnóstico de este nuevo ensayo, la proteína IFN-α en plasma y el suero de individuos sanos se midieron y compararon con muestras de pacientes con SLE y JDM. Como se ilustra en la figura 7, se detectaron altos niveles de la proteína IFN-α en ambas cohortes de enfermedad en comparación con controles sanos. La línea punteada indica el LDD de un convencional ELISA disponible comercialmente, que ilustran cómo este enfoque no detectaría la proteína IFN-α en estos grupos de pacientes a pesar de las asociaciones conocidas de esta citoquina con estos fenotipos. Además, IFN-α podría cuantificarse en 5 registros de magnitud, que ilustran el amplio rango dinámico del ensayo, con niveles detectables entre 1-10 fg/mL confirma el carácter altamente sensible de la prueba. Figura 7: cuantificación de la proteína IFN-α en plasma y suero de paciente cohortes. Esta figura ha sido modificada de Rodero et al. 2017. plasma de controles sanos (n = 20) y pacientes que sufren de SLE (n = 72) y JDM (n = 43) se probaron en el ensayo de matriz pan-IFNα sola molécula. Análisis se realizan mediante la prueba ANOVA unidireccional (Kruskal-Wallis) y Dunn comparación entre grupos. Se representa la mediana. Línea punteada indica LOD de un referencia humana ELISA de anti-IFN-α (pg/mL 1.95 = 1950 fg/mL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Paso Consideraciones Referencia 1. elección de pareja anticuerpo Objetivo diferentes epítopes Tabla 2 Alta afinidad Rápido Ken / lento Kapagado 2. orientación del par de anticuerpos Elegir las condiciones con el más bajo límite de detección Figura 1 3. concentración de anticuerpo de captura 4. proporción de anticuerpos biotina: Detector 5. 2 vs. configuración de 3 pasos Escoger la condición con el cociente más alto de la señal: fondo Figura 2 6. concentración de anticuerpo detector Elegir las condiciones con el más bajo límite de detección Figura 3 7. concentración SBG 8. especificidad Evaluar reactividad cruzada Figura 4 9. sensibilidad Evaluar el reconocimiento de subtipos (si corresponde) 10. reproducibilidad Evaluar la variabilidad del ensayo Figura 5 Tabla 1: Resumen de pasos para el desarrollo y optimización de un análisis de la matriz de la sola molécula. Esta tabla resume los diferentes pasos necesarios para el desarrollo y optimización de un análisis de matriz de molécula única, de la elección inicial del par de anticuerpos hasta la evaluación de la reproducibilidad. Antígeno de 8H 1 (A) 12H 5 (B) Sifalimumab Rontalizumab IFNΑ1 28.3 51,3 460 22.63 IFNΑ2 2563 10.7 9.02 2.15 IFNΑ4 5.11 2.99 35.35 325.3 IFNΑ5 2.01 19.6 93.29 2.49 IFNΑ6 64.7 3.03 4.97 – IFNΑ7 0,9 0,63 233.1 – IFNΑ8 302 0,83 691 10.86 IFNΑ10 2.54 0.71 43.2 – IFNΑ14 3224 2.1 14.52 0,9 IFNΑ16 1,83 32.99 59.18 28.65 IFNΑ17 2.21 0.77 890.9 23.86 IFNΑ21 2.78 12.87 1769 5.8 Tabla 2: selección de anticuerpos alfa Pan. IC50 (ng/mL) determinada mediante el elemento de respuesta interferón-estimulantes (ISRE)-ensayo de neutralización de luciferasa. Tabla muestra valores de IC50 de mAbs utilizados en análisis de matriz de molécula única para todos los subtipos de IFN-α. 10.000 células de HEK 293 MSR fueron sembradas en placas de 96 pocillos de área mitad blanco y reverso-transfected con 50 ng premezclado ISRE-Firefly luciferase reporter y construcciones de luciferasa Renilla transfección reactivos según las instrucciones del fabricante. La construcción de expresión de luciferasa sirve como control interno de la normalización. Las células fueron incubadas durante la noche en reducido suero suplementado con aminoácidos no esenciales de 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM, 0,5% de suero fetal bovino a 37 ° C, 5% CO2 en un ambiente humidificado. Después de la incubación durante la noche, las células fueron estimuladas por 24 h con medio que contiene mezclas de recombinante humano IFN-α con o sin mAbs anti-IFN-α o control IgG que había se incuba durante 1 h a 37 ° C. Después de 24 h de estimulación, dual luciferase reporter ensayos fueron realizados según las instrucciones del fabricante. «-» No determinado. Sifalimumab es un humano, inmunoglobulina G1 κ anticuerpo monoclonal que se une y neutraliza la mayoría de los subtipos de IFN-α; Rontalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra IFN-α. Adaptado de Meyer et al. 2016 y Rodero et al. 2017. Complementario tabla 1: selección de la orientación del anticuerpo, captura la concentración de anticuerpos en los granos y el cociente de Biotinilación. Las dos posibles configuraciones diferentes fueron probadas, con el anti-IFN-α como anticuerpo de captura y B anti-IFN-α como detección anticuerpo (A) y vice versa (B). IFNα – 2C se utilizó como antígeno. Las concentraciones de anticuerpo de captura diferentes así como ratios de biotina: anticuerpo (B:A) también fueron probadas para ambas configuraciones. Saturación (Sat). Naranja: Valores AEB que se utilizaron para el cálculo de LOD; Estas concentraciones eran consideradas en blanco como los AEB valores permanecidos constantes. LOD se calculó como la media en blanco + 3de. haga clic aquí para descargar este archivo. Adicional cuadro 2: prueba de configuración de 3 pasos de 2 vs. Las configuraciones de paso 2 y 3 – se evaluaron con IFNα – 2c como antígeno. AEB valores así como señal/fondo raciones (SG) se muestran para ambas condiciones. Haga clic aquí para descargar este archivo. Adicional cuadro 3: optimización de concentración Detector y SBG. Tres diferentes concentraciones de anticuerpo detector de biotinilado (0.1, 0.3 y 0.6 μg/mL) junto con tres diferentes concentraciones de SBG (50, 150 y 250 pM) fueron evaluados. AEB valores se muestran para las nueve condiciones de prueba. Naranja: Valores AEB que se utilizaron para el cálculo de LOD; Estas concentraciones eran consideradas en blanco como los AEB valores permanecidos constantes. LOD se calculó como la media en blanco + 3de. haga clic aquí para descargar este archivo. Adicional cuadro 4: especificidad y sensibilidad de la prueba de conjunto optimizada de IFNα sola molécula. Enzima promedio por valores de granos aparecen cuando IFN-β, IFN-λ1, λ2 IFN, IFN-ω y IFN-γ proteínas recombinantes fueron probaron (A), junto con los 16 subtipos de IFN-α (B). «-» No determinado. Haga clic aquí para descargar este archivo. Adicional cuadro 5: reproducibilidad del optimizado IFNα sola molécula matriz análisis. Se muestran los valores promedio de la AEB para todos tres carreras independientes a una concentración de 10.000 fg/mL. «-» No determinado. Saturación (Sat). Haga clic aquí para descargar este archivo. Complementario tabla 6: Análisis de proteína competencia. Enzima promedio por cuentas de valores se muestran para todas las condiciones probadas. Las mediciones se realizaron por duplicado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Adjunto, describimos el desarrollo y validación de un sola molécula altamente reproducible, ultrasensible matriz digital ELISA para la cuantificación directa de la proteína IFN-α en muestras humanas (pasos resumidos en la tabla 1). Uno de los pasos más críticos en el desarrollo del ensayo es la elección del anticuerpo par16, con las características en cuanto a la cinética y del epítopo vinculante siendo clave para un análisis acertado. Es importante evitar el uso de anticuerpos monoclonales apareados que destino el mismo epitopo o que causan impedimento estérico. Anticuerpos policlonales podrían utilizarse como anticuerpos de detección para superar tales limitaciones. Si en cualquier etapa dada la sensibilidad deseada no se logra, más posibilidades de optimización se deben considerar. Esto puede incluir el uso de pares de anticuerpos alternativos, cambios en parámetros como el tipo de proteína (por ejemplo, BSA < caseína), pH (6.0-8.5), fuerza iónica, capacidad tampón (por ejemplo, concentraciones de NaCl y fosfato), granos del portador, o la presencia de tensioactivos. Una amplia gama de parámetros con optimizarse en el desarrollo de un análisis de matriz de molécula única. Sin embargo, en general, condiciones que le dan proporciones de alta señal: fondo y LODs mínima son los preferidos (ver figura 1, figura 2y figura 3).

En cuanto a la especificidad, el ensayo del IFN-α demostraron ninguna reactividad cruzada para cualquier otros IFN probado (β, γ, λ1, λ2, ω) (figura 4a) y fue capaz de detectar los 13 subtipos de IFN-α (Figura 4b). Sin embargo, el ensayo demostró una menor afinidad por el subtipo de IFN α2, (Figura 4b y complementario tabla 4). Curiosamente, diferentes sensibilidades de las diferentes clases de IFN-α2 (a, b, c) también observaron, que puede ser debido a procesos de fabricación diferentes o secuencias de aminoácidos diferentes, como los subtipos de IFN α2 se obtuvieron de diferentes comerciales proveedores. Con esta sola excepción, todas las especies de IFN-α dieron respuestas muy similares. La especificidad de la prueba quedó demostrada además por tratamiento previo de las muestras con anti-IFN-α un clon, que derogó la señal (figura 6 y cuadro complementario 6).

Una de las principales ventajas de esta tecnología es que cualquier analito de interés puede ser potencialmente objetivo16. Además, pueden analizarse diferentes especímenes biológicos, tales como suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, Lisados celulares, cultura sobrenadantes31 y respiración hasta32. Generalmente, se realiza una dilución de 1:3 de plasma para evitar la obstrucción potencial del analizador array sola molécula. Sin embargo, el analito de interés puede estar presente en muy bajas concentraciones en la muestra biológica relevante y concentraciones más altas de la muestra podrían ser necesario (dependiendo de la sensibilidad del ensayo)33. Aunque existe la posibilidad de multiplexación manteniendo buena sensibilidad34, es un proceso más difícil y ensayos para la medición de más de 6 proteínas dentro de los experimentos mismos tienen todavía ser desarrollado35.

La capacidad de detección y cuantificación de citoquinas y otras proteínas biológicas pertinentes en tales concentraciones bajas se abre toda una nueva gama de aplicaciones33,36. Es bien sabido que numerosas proteínas ejercen sus efectos incluso en concentraciones muy bajas, que hasta ahora estaban por debajo del límite de detección de los ELISA mejor37. Mientras que otras tecnologías de inmunoensayo ofrecen ventajas sobre los convencionales ELISA19, demostramos aquí que a la sola molécula matriz digital es una plataforma robusta y reproducible para la detección ultrasensible de baja concentración de citoquinas en muestras humanas. Esta tecnología ofrece gran potencial para el descubrimiento de biomarcadores y mejor manejo de pacientes de una amplia gama de enfermedades.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DD y YJC reconocen apoyo de la ANR (proyecto IFNX, no. CE17001002) y ImmunoQure AG para proporcionar anticuerpos monoclonales. Agradecemos a Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki y Pierre Quartier para proporcionar las muestras clínicas. YJC reconoce el Consejo Europeo de investigación (GA 309449: Beca de YJC) y un subsidio del estado a cargo de la Agencia Nacional de investigación (Francia) bajo el programa de “Inversiones para el futuro”, teniendo la referencia ANR-10-IAHU-01.

Materials

Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex
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References

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Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).
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