Hier präsentieren wir ein Protokoll um die Entwicklung und Validierung eines einzelnen Moleküls Array digitale ELISA Assays, ermöglicht ultra-sensitive Detektion von allen IFN-α-Subtypen in humanen Proben zu beschreiben.
Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung und Validierung einer Interferon (IFN) beschreiben-α Einzelmolekül Array digitale Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Assay. Dieses System ermöglicht die Quantifizierung des menschlichen IFN-α Proteins mit noch nie da gewesenen Sensibilität, und keine Kreuzreaktivität für andere Arten von IFN.
Der erste wichtige Schritt des Protokolls ist die Wahl des Antikörper-Paars, gefolgt von der Konjugation des Antikörpers erfassen paramagnetischen Perlen und biotinylierungen von den detektionsantikörper. Nach diesem Schritt können verschiedene Parameter wie Test-Konfiguration, Detektor antikörperkonzentration und Puffer Zusammensetzung geändert werden, bis die optimale Empfindlichkeit erreicht ist. Schließlich sind Spezifität und Reproduzierbarkeit der Methode bewertet, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Hier entwickelten wir eine IFN-α Einzelmolekül Array Assays mit einem Limit von Erkennung von 0,69 fg/mL mit hoher Affinität Autoantikörper von Patienten mit biallelische Mutationen im autoimmune Regulator (AIRE) Protein verursacht autoimmune Polyendocrinopathy isoliert Syndrom Typ 1/autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-ektodermalen Dystrophie (APS1/APECED). Wichtig ist, aktiviert diese Antikörper Nachweis von allen 13 IFN-α-Subtypen.
Diese neue Methode ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von IFN-α-Protein im menschlichen biologischen Proben in Attomolar Konzentrationen zum ersten Mal. Ein solches Instrument werden sehr nützlich bei der Überwachung der Ebenen dieses Zytokin in Gesundheit und Krankheit Staaten und vor allem Infektionen, Autoimmunität, Autoinflammation.
Art I IFNs sind eine Familie von Zytokinen, die eine zentrale Rolle in der Orchestrierung antivirale Immunantwort. Sie wurden zuerst von Isaacs und Lindenmann 60 Jahren entdeckt,1,2 , und es ist nun bekannt, dass diese heterogene Familie von Polypeptiden besteht aus 14 verschiedenen Unterklassen (13 IFN-α-Subtypen und 1 IFN-β). Ich IFNs sind unerlässlich, um die Räumung von Virusinfektionen, sondern haben auch in der Pathologie der unterschiedlichsten Krankheiten Staaten, darunter die Autoimmunerkrankungen systemischer Lupus erythematodes (SLE), juvenile Dermatomyositis (JDM), in Verbindung gebracht und der Typ Ich Interferonopathies in welchem konstitutive Ergebnisse I IFN-induzierte Signalisierung in Pathologie3,4,5,6,7.
Studium der Typ I IFN Protein Ebenen in biologischen Proben ist seit seiner ersten Identifikation als eine “störenden Substanz”1,2herausfordernd. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) ist derzeit die am weitesten verbreitete Methode zur Erkennung von IFN-α-Protein. Trotz des Seins gezielte, einfache und schnelle, Typ I IFN ELISAs vorhandene wichtige Einschränkungen, z. B. begrenzte Empfindlichkeit. Darüber hinaus erfordert die Messung alle IFN-α-Subtypen den Einsatz von mehreren Tests mit eigenen Erkennung Kapazität und Empfindlichkeit. Zwar gibt es kommerzielle ELISAs, die verschiedene Subtypen des IFN-α zu erkennen, ihre Empfindlichkeit ist begrenzt (1,95 Pg/mL, 12,5 Pg/mL und 12.5 Pg/mL, beziehungsweise) die ist oft unzureichend, IFN-α Proteins in biologischen Proben zu erkennen. Um diese Einschränkung zu umgehen, Typ I IFN mehrere biologische Proxy-Assays wurden entwickelt, um die Quantifizierung durch Messung induzierte Genexpression oder funktionelle Aktivität8,9,10,11, 12 , 13 , 14. dennoch diese Tests bieten kein direktes Maß für die IFN-α-Protein.
In dieser Studie wurde Einzelmolekül Array ELISA Digitaltechnik verwendet, um einen Test zum Nachweis von einzelnen IFN-α-Protein-Moleküle zu entwickeln. Digitalen ELISA nutzt die gleichen grundlegenden Chemie als konventionellen ELISA, jedoch die Reaktion findet statt in Arrays bestehend aus 50.000 einzelne 46 Femtoliter Größe Brunnen15,16. Einzelne Proteinmoleküle durch Antikörper-beschichtete paramagnetischen Perlen erfasst und mit einem biotinylierte detektionsantikörper, gefolgt durch die Bindung an ein Enzym-Konjugat Streptavidin-β-Galaktosidase (SBG) gekennzeichnet. Anschließend werden die Perlen mit einem Fluorogenic Enzym-Substrat, Resorufin-β-D-Galactopyranoside (RGP) in Einzelmolekül-Arrays ausgesetzt. Durch die Verringerung des Volumens Reaktion 2 Milliarden Mal17, eine hohe lokale Konzentration von Fluoreszenzsignal erreicht und Einzelmolekül zählt sind möglich, wie jedes Molekül erzeugt ein Signal, das nun zuverlässig sein kann gemessen18. Im Wesentlichen können Einzelmolekül-Arrays zählen einzelne Immunocomplexes und die Festlegung einer durchschnittlichen Anzahl von Enzymen pro Perle (AEB). Zählen die Mikrovertiefungen, in denen ein Signal erkannt wird, erlaubt Quantifizierung/Digitalisierung der Protein-Moleküle, da gibt es eine direkte Korrelation zwischen Proteinkonzentration und das Verhältnis zwischen Immunocomplexed-Perlen und eine Gesamtanzahl von Perlen in vorhanden die Femtoliter große Kammern.
Yeung Et Al. eine umfangreiche Cross-Plattform-Evaluierungsstudie mit neun verschiedenen Technologien und vier Zytokin-Immunoassays für den Vergleich der Assay-Präzision, Sensibilität und Datenkorrelation über die verschiedenen Plattformen19durchgeführt. Eines der wichtigsten Ergebnisse der Studie war, dass Einzelmolekül-Arrays und Einzelmolekül Immunoassay zählen die höchste Empfindlichkeit zur Erkennung von Zytokinen in humanem Serum innerhalb der Sub-Pg/mL Konzentrationsbereich vorgestellt. Einzelmolekül Array digitale ELISA Zytokin Assays wurden verwendet, um die Untersuchung der Rolle von TNF-α und IL-6 in Crohns Krankheit20, IFN-α in Interferonopathy und Auto-immun-Patienten 7, und die verschiedenen posttranslational modifiziert Formen des C-X-C Motiv-Chemokin 10 (CXCL10) in chronischer Hepatitis und gesunden Spendern erhalten Sitagliptin21,22. Weitere Anwendungen sind die Messung von Rhodopsin bei Patienten mit diabetischer Retinopathie23; die Untersuchung von Gehirn Pathologien durch Serum/Plasma Messungen der Neurofilamente Licht24 und Amyloid-β 1-42 Peptid25im Zusammenhang mit Multipler Sklerose und Alzheimer-Krankheit, beziehungsweise. Einzelmolekül Array Assays können auch für verbesserte Erregernachweis z. B. Charakterisierung der HIV Virus-Reservoir26, und auch für die Erkennung von DNA-27 und Mikro-RNAs28verwendet werden. Ein großer Vorteil der Einzelmolekül-Array-Technologie ist diese hohe Vielseitigkeit, wie ein Test gegen jeden Analyten von Interesse entwickelt werden kann, wenn ein spezifischer Antikörper-paar zur Verfügung steht. Darüber hinaus sind Homebrew Assay Kits im Handel erhältlich, soll die Entwicklung von neue Assays, das, die Protokoll die in abgewandelter Form unten beschrieben wird.
Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Entwicklung und Validierung Schritte für ein einzelnes Molekül Array Assays, dass die Ergebnisse in erweiterte Empfindlichkeit für IFN-α Proteindetektion präsentiert. Antikörper für Einzelmolekül Array Assays sollte hochspezifische, Kreuz Reaktivität mit Verwandte Proteine (mit Arten Spezifität berücksichtigt, falls relevant) zu vermeiden. Im Idealfall sollte die Antikörper mit einem K-D kleiner als 10-9 M gewählt werden; hoher Affinität sorgt für starke Bindung mit der Produktion von einem höheren Signal. Die Kinetik der Antikörper-Antigen-Bindung sind auch wichtige und schnelle Kauf und langsam Koff wird Antigen-Antikörper-komplexen Baugruppe begünstigen. Beginnend mit einem Antikörper-Paar, das eine gute Leistung in klassischen ELISA, mit einer Begrenzung der Nachweisgrenze (LOD) von 1-100 Pg/mL, hat erhöht die Chancen auf einen hochempfindlichen Einzelmolekül-Array-Assay. Chang und Kollegen führte detaillierte kinetische Untersuchungen der biomolekularen Wechselwirkungen auftreten bei jedem einzelnen Schritt, schlägt eine Reihe von Gleichungen, analytische Empfindlichkeit18vorherzusagen. Sie zeigten dieses Einzelmolekül-Array digitale ELISA wirksam innerhalb einer breiten Palette von Antikörper Affinitäten zu sein scheint (KD ~ 10−11 – 10−9 M), ebenso wie die Signalerzeugung abhängiger auf der Rate der solche Antikörper ist.
Um hohe Affinität zu nutzen geben wir Antikörper isoliert von Patienten mit dem Syndrom autoimmune Polyendocrinopathy nutzten Antikörper 1/autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-ektodermalen Dystrophie (APS1/APECED)29. Aus Gründen, die noch nicht erforscht sind, wird die große Mehrheit der AIRE-defizienten Personen entwickeln eine Reihe von hoch-Avidität Antikörper gegen alle IFN-α-Subtypen29und ausgewählt wurden zwei Anti-IFN-α-Antikörper Klone von ergänzenden verbindliche Affinitäten für die IFN-α Subtypen, als durch IC50 Werte geschätzt. Die Kombination dieser einzigartigen High-Affinität Antikörper mit Einzelmolekül-Array-Technologie ermöglicht die direkte Quantifizierung der IFN-α bei Konzentrationen von Attomolar (fg/mL). So empfindsamen IFN-α Proteindetektion trägt zu einem besseren Verständnis der Natur, Verordnung und biologische Wirkung der IFN-induzierte Reaktion in verschiedenen Krankheiten Einstellungen.
Hier beschrieben wir die Entwicklung und Validierung von einer hoch reproduzierbare, Gromer Einzelmolekül Array digitale ELISA für direkte Quantifizierung des IFN-α Proteins in humanen Proben (Schritte in Tabelle 1zusammengefasst). Einer der wichtigsten Schritte bei der Entwicklung des Tests ist die Wahl der Antikörper Paar16, mit den Eigenschaften in Bezug auf die Kinetik und Epitop Bindung als Schlüssel zu einem erfolgreichen Test. Es ist wichtig, vermeiden den Einsatz von gekoppelte monoklonale Antikörper, die gezielt das gleiche Epitop oder sterische Behinderung verursachen. Polyclonal Antikörper könnte als Erkennung Antikörper verwendet werden, um diese Beschränkungen zu überwinden. Wenn die gewünschte Empfindlichkeit bei jedem gegebenen Schritt nicht erreicht wird, sollte weitere Optimierungsmöglichkeiten betrachtet werden. Dazu gehören die Verwendung von alternativen Antikörper Paare, Änderungen in den Parametern wie proteintyp (z.B. BSA < Kasein), pH (6,0-8,5), Ionenstärke, Pufferkapazität (z.B. NaCl und Phosphat-Konzentrationen), Träger Perlen und/oder Anwesenheit von Tensiden. Eine Vielzahl von Parametern werden con optimiert, wenn einen einzelnes Molekül Array Assay Entwicklung. Jedoch insgesamt Bedingungen, die hohe Signal: Hintergrund-Verhältnisse und minimale LODs geben die sind bevorzugt (siehe Abbildung 1, Abbildung 2und Abbildung 3).
Hinsichtlich Spezifität, der IFN-α-Test zeigte kein Kreuz Reaktivität für andere IFNs getestet (β, γ, λ1, λ2, ω) (Abb. 4a) und war in der Lage alle 13 IFN-α-Subtypen (Abbildung 4 b). Der Test ergab jedoch eine geringere Affinität für die IFN-α2-Subtyp, (Abbildung 4 b und ergänzenden Tabelle 4). Interessanterweise wurden unterschiedliche Empfindlichkeiten für die einzelnen Klassen der IFN-α2 (a, b, C) auch beobachtet, die möglicherweise aufgrund unterschiedlichen Herstellungsverfahren oder andere Aminosäure-Sequenzen, wie die IFN-α2-Subtypen aus verschiedenen kommerziellen gewonnen wurden, Lieferanten. Mit dieser einzigen Ausnahme gab die IFN-α-Arten sehr ähnliche Reaktionen. Die Spezifität des Assays zeigte sich weiter durch Vorbehandlung der Proben mit der Anti-IFN-α ein Klon, die das Signal (Abb. 6 und ergänzenden Tabelle 6) aufgehoben.
Eines der wichtigsten Vorteile dieser Technologie ist, dass alle Analyten von Interesse kann potenziell gezielte16. Darüber hinaus können verschiedenen biologische Proben getestet werden, wie z. B. Serum, Plasma, Liquor cerebrospinalis, zelluläre Lysates, Kultur Überstände31 und sogar Atem32. In der Regel ist eine Verdünnung von 1:3 von Plasma durchgeführt, um zu vermeiden, mögliche Verstopfung der Einzelmolekül-Array-Analysator. Jedoch der Analyten von Interesse in sehr geringen Konzentrationen in die relevanten biologischen Probe vorhanden sein könnten und möglicherweise höhere Konzentrationen der Probe erforderlich (je nach Empfindlichkeit der Assay)33. Obwohl es Potenzial gibt für multiplexing unter Beibehaltung guter Empfindlichkeit34, ist es ein schwieriger Prozess und Assays für die Messung von größer als 6 Proteine innerhalb der gleichen Experimente haben noch35werden entwickelt.
Die Fähigkeit zu erkennen und zu quantifizieren, Zytokine und andere biologische relevante Proteine bei so niedrigen Konzentrationen eröffnet eine ganze Reihe neuer Anwendungen33,36. Es ist bekannt, dass zahlreiche Proteine ihre Wirkung auch bei sehr geringen Konzentrationen, ausüben, die bisher unter der Nachweisgrenze der besten ELISAs37lagen. Während andere Immunoassay-Technologien Vorteile gegenüber konventionellen ELISA19 bieten, zeigen wir hier, dass Einzelmolekül Array digitale ELISA eine reproduzierbare und robuste Plattform für den empfindsamen Nachweis geringer Konzentration Zytokine in ist humanen Proben. Diese Technologie bietet enormes Potenzial für die Entdeckung von Biomarkern und verbesserte Patientenmanagement eine Vielzahl von Krankheiten.
The authors have nothing to disclose.
DD und YJC anerkennen, Unterstützung von der ANR (Projekt IFNX, keine. CE17001002) und der ImmunoQure AG für die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern. Wir danken Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki und Pierre Quartier für die Bereitstellung von klinischer Proben. YJC erkennt das European Research Council (GA 309449: Stipendium für YJC), und einer staatlichen Förderung durch die National Research Agency (Frankreich) unter der “Investitionen für die Zukunft”-Programm mit der Referenz ANR-10-IAHU-01 verwaltet.
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone | eBioscience | BMS216C | |
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone | eBioscience | BMS216BK | Not an ELISA kit but bulk abs |
IFN α2c | eBioscience | BMS305 | OK |
IFN αI (17) | PBL | 11150-1 | |
IFN α2a | PBL | 11100-1 | |
IFN α2a | PeproTech | No longer available | |
IFN α2b | PBL | 11105-1 | |
IFN α1 | PBL | 11175-1 | |
IFN α4a (M1) | PBL | 11177-1 | |
IFN α4b (a4) | PBL | 11180-1 | |
IFN αB2 (a8) | PBL | 11115-1 | |
IFN αC (a10) | PBL | 11120-1 | |
IFN αD (a1) | PBL | 11125-1 | |
IFN αG (a5) | PBL | 11135-1 | |
IFN αF (a21) | PBL | 11130-1 | |
IFN αH2 (a14) | PBL | 11145-1 | |
IFN αJ1 (a7) | PBL | 11160-1 | |
IFN αK (a6) | PBL | 11165-1 | |
IFN αWA (a16) | PBL | 11190-1 | |
IFN λ1 | PeproTech | 300-02L | |
IFN λ2 | PeproTech | 300-02K | |
IFN ω | PeproTech | 300-02J | |
IFN β | PeproTech | 300-02BC | |
IFN γ | PeproTech | 300-02 | |
Anti-IFN-α ELISA | PBL | 41115.1 | |
96-well plates | Corning | 3904 | |
ISRE-Reporter | Qiagen | CCS-008L | |
Fu-GENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem | ThermoFischer Scientific | 31985062 | |
Dual-Luciferase Reporter assay | Promega | E1910 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Spectrophotometer NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | No longer available | |
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres | Merck Millipore | UFC505096 | |
Bead Conjugation Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Non-Encoded Paramagnetic Beads | Quanterix | 101360 | |
Bead Wash Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
EDC | Fisher Scientific | 11844071 | |
Bead Blocking Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Bead Diluent Buffer | Quanterix | 101362 | |
Detector and Sample Diluent | Quanterix | 101359 | |
Biotinylation Reaction Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
NHS-PEG4-Biotin | Fisher Scientific | 11891195 | |
diH2O | |||
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) | Thermo Scientific | 75002478 | |
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) | IKA | MS2 | |
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
1.7mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) | VWR | 521-2844 | |
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) | Eppendorf | ||
Single molecule array (Simoa) reagents | |||
SBG, Bead and Detector Barcode Labels | Quanterix | 101652 | |
15 mL Reagent Bottles | Quanterix | 102411 | |
Simoa specimen 96-well plates | Quanterix | 101457 | |
Simoa Discs | Quanterix | 100001 | |
Simoa 2.0 conductive Tips | Quanterix | 101726 | |
Simoa Cuvettes | Quanterix | 100803 | |
Simoa SBG Reagent | Quanterix | 102295 | |
Simoa RGP Reagent | Quanterix | 101736 | |
Simoa System Buffer 1 | Quanterix | 100486 | |
Simoa System Buffer 2 | Quanterix | 100487 | |
Sealing Oil | Quanterix | 100206 | |
ddH2O | |||
Simoa HD-1 Analyzer | Quanterix | 100032 | |
Technologies | |||
Single molecule array (Simoa) | Quanterix | ||
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems | Singluex |