Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans
Summary
Una guía paso a paso para la pérdida de acidez lysosomal en el intestino de C. elegans con el colorante vital sensible a pH 6 – carboxi – 2′, 7′-Diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)
Abstract
El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un modelo que es ampliamente utilizado para el estudio de longevidad y las vías de desarrollo. Tales estudios son facilitados por la transparencia de los animales, la capacidad de marcha adelante y atrás ensayos genéticos, la relativa facilidad de generar proteínas fluorescencia de etiquetado y el uso de tintes fluorescentes que tampoco puede ser microinyectados en el temprano embrión o incorporado en su alimento (e. coli cepa OP50) etiquetar organelos celulares (e.g. 9-dietilamino-5 H-benzo (a) fenoxazina-5-one y (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} – N – [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aquí, presentamos el uso de un fluorescente tinte pH-sensible que tiñe lisosomas intestinales, proporcionando una lectura visual de los cambios dinámicas, fisiológicas en acidez lysosomal en gusanos vivos. Este protocolo no mide pH lisosomal, sino más bien tiene por objeto establecer un método confiable de evaluación fisiológicas variaciones relevantes en acidez lysosomal. cDCFDA es un compuesto celular florescente que es convertido a fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) al producirse la hidrólisis por esterasas intracelulares. Protonación dentro de lisosomas trampas cDCF en estos orgánulos, donde se acumula. Debido a su bajo pKa de 4.8, este colorante se ha utilizado como un sensor de pH en la levadura. Aquí describimos el uso de cDCFDA como suplemento del alimento para determinar la acidez de lisosomas intestinales en C. elegans. Esta técnica permite la detección de alcalinizantes lisosomas en animales vivos, y tiene una amplia gama de aplicaciones experimentales, incluyendo estudios sobre envejecimiento, autofagia y biogénesis lisosomal.
Introduction
La aparición de agregados proteicos es ampliamente aceptada que un sello de envejecimiento en las células eucariotas1,2,3y la formación de los cuales se cree que entre los conductores de principio de senescencia celular4 , 5 , 6 , 7. Existe creciente evidencia que como células edad, catabolismo proteico se deteriora, provocando un aumento en la agregación de la proteína. El colapso de la proteólisis en el envejecimiento de las células conlleva una debilitación de la autofagia8 , así como de la degradación de proteínas mediada por proteasoma9. Finalmente, oxidación irreversible de la proteína aumenta en las células viejas, deteriorando aún más proteína catabolismo10.
Autofagia fue pensada inicialmente para ser un proceso no selectivo para la degradación de la mayor parte de proteínas dañadas, pero estudios recientes han indicado que la autofagia es altamente selectiva para el catabolismo de los agregados de proteínas y organelos disfuncionales que no son susceptibles a la degradación a través de otras proteínas separación mecanismos11. Durante el proceso de autofagia, proteínas dañadas y agregadas son secuestradas en una vesícula de membrana doble llamada el autophagosome. Este autophagosome entonces se funde con los ácidos organelos llamados lisosomas, que conduce a la degradación de la carga de autophagosome12. Lisosomas representan el punto final de la vía de la autofagia y participan en diversos procesos celulares tales como reparación de membrana, control transcripcional y detección de nutrientes; destacando su papel centralizado en la homeostasis celular (revisada en Ref. 13). Varios estudios han demostrado una asociación entre una disminución dependiente de la edad en la función lisosomal y de trastornos neurodegenerativos diversos13. Constantemente, restaurar la función lysosomal en células mayores puede retrasar la aparición de fenotipos relacionados con el envejecimiento14,15. Estudios de la composición del medio intralumen sugieren que el colapso de la función lysosomal en células mayores no es debido a una reducción en la producción de proteasas lisosomales16. Por otra parte, se ha propuesto que la pérdida de acidez produce, un requisito fundamental de su actividad enzimática, puede ser la base la disminución de la proteólisis mediada por el lisosoma17. Para poder explorar esta hipótesis, es esencial desarrollar los reactivos y protocolos para cambios dinámicos en pH lisosomal en células vivas de una manera coherente y replicable.
El intestino de C. elegans es el tejido metabólico importante en gusanos y es un regulador crítico de la homeostasis sistémica y la vida útil. Desarrollamos análisis para evaluar los cambios en la acidez del lumen intestinales lisosomas de gusanos para determinar cómo lisosoma-mediada de la proteólisis contribuye al envejecimiento. Aunque fluoróforos sensibles al pH han sido utilizados previamente en C. elegans para marcar lisosomas intestinales, sin embargo no ha habido un esfuerzo por establecer un protocolo exitoso que puede detectar pequeños incrementos en el pH lisosomal en vivo18. Presentamos un protocolo que puede utilizarse para detectar pérdida de acidez lisosomal de las células intestinales de C. elegans mediante un protocolo de alimentación sencillo y cómodo que incorpora un fluoróforo sensible al pH (cDCFDA) OP50 alimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una variedad de eventos celulares y moleculares que contribuyen al envejecimiento, influenciado por características de historia de vida y factores genéticos. Nuestro reciente estudio22 sugiere que el ciclo reproductivo juega un papel importante en el control de la aptitud del soma a través de la regulación de la dinámica de pH lisosomal. Hemos mostrado que proteolisis lisosomal mediada es promovido mientras que animales se reproducen activamente upregulation de la transcripción de la v-ATPas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a centro Caenorhabditis genética de las cepas, las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) y la Fundación de Canadá para la innovación (CFI) para la financiación. Nos gustaría agradecer a Dr. Lizhen Chen (Departamento de sistemas celular y anatomía, UT salud San Antonio) para permitir el uso irrestricto de sus instalaciones de laboratorio para todos los experimentos de C. elegans , así como el Dr. Exing Wang (Director asociado, centro de la proyección de imagen óptica UT salud San Antonio) para obtener ayuda con microscopía confocal. También nos gustaría agradecer a Dr. Myron Ignatius para proporcionar apoyo y aliento para facilitar la sesión de video.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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