Оценка лизосомальных подщелачивание в кишечнике Live Caenorhabditis elegans
Summary
Пошаговое руководство для проверки потери лизосомальных кислотности в кишечнике C. elegans с помощью РН чувствительных жизненно красителя 5 (6) – карбоксильную – 2′, диацетата 7′-dichlorofluorescein (cDCFDA)
Abstract
Нематоды Caenorhabditis elegans (C. elegans) является модель системы, которая широко используется для изучения долголетия и пути развития. Такие исследования способствуют прозрачности животного, возможность прямого и обратного генетических анализов, относительная простота генерации дневно обозначенные протеины и использование флуоресцентных красителей, которые могут быть либо microinjected в начале эмбриона или включены в питание (штаммE. coli ОР50) для обозначения клеточных органелл (например 9-диэтиламино-5 H-бензо (а) феноксазин-5-1 и (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-пиррол-5-yl-kappaN} – N – [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Здесь мы представляем использование Люминесцентную краску pH фактора, что пятна кишечных лизосомы, обеспечивая визуального Индикация динамического, физиологические изменения в лизосомальных кислотности в живые черви. Этот протокол не измерить лизосомальных рН, а скорее стремится создать надежный метод оценки физиологической релевантные варианты в лизосомальных кислотности. cDCFDA является ячейка permeant соединение, которое преобразуется в люминесцентных Флюорофор 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) после гидролиза внутриклеточных эстераз. Протонирование внутри лизосомы ловушки cDCF в эти органеллы, где он накапливается. Из-за его низкой pKa 4.8 Эта краска используется в качестве датчика рН в дрожжей. Здесь мы описываем использования cDCFDA в качестве пищевой добавки для оценки кислотность кишечного лизосом в C. elegans. Эта техника позволяет для обнаружения alkalinizing лизосом в живых животных, и имеет широкий спектр экспериментальных приложений, включая исследования по вопросам старения, autophagy и лизосомальных биогенеза.
Introduction
Появление белка агрегатов широко принято быть отличительной чертой старения в эукариотической клетки1,2,3и формирование которого считается среди водителей принцип сотовой старение4 , 5 , 6 , 7. имеется все больше свидетельств того, что как клетки возраст, катаболизм белков нарушается, привело к увеличению в агрегации белков. Крах протеолиза в процессе старения клеток предполагает ухудшение autophagy8 , а также деградации белка протеасом опосредованной9. Наконец необратимым белка окисления увеличивается в старых клеток, дальнейшего ущерба катаболизма белков10.
Подуманы, что autophagy был первоначально неизбирательной процесс для сыпучих деградации белков, поврежденных, но недавние исследования показали, что autophagy высокоселективных для катаболизма белка агрегатов и неблагополучных органеллы, которые не являются поддаются деградации через механизмы других белков в Распродажа11. Во время процесса autophagy поврежденные и агрегированных белки изолированы в двойной мембраной пузырьков, под названием autophagosome. Этот autophagosome затем предохранители с кислой органеллы, называется лизосомы, что приводит к деградации autophagosome груза12. Лизосомы представляют конечной autophagic пути и участвуют в различных клеточных процессах, таких как ремонт мембраны, транскрипционный анализ контроля и питательных зондирования; подчеркивая их централизованной роли клеточного гомеостаза (обзор в ref. 13). Несколько исследований показали связь между возрастом зависимых снижением лизосомальных функции и различных нейродегенеративных расстройств13. Последовательно восстановление лизосомальных функции в старые клетки могут отсрочить наступление связанных со старением фенотипов14,15. Исследования состава intralumen окружение предлагают, что крах лизосомальных функции в старые клетки не из-за сокращения производства лизосомальных протеаз16. Кроме того было предложено, что потеря intralysosomal кислотность, критическим требованием о ее Ферментативная активность, могут лежать в основе падение Лизосома опосредованной протеолиза17. Чтобы иметь возможность изучить эту гипотезу, важно развивать реагентов и протоколы зонда динамических изменений в лизосомальных рН в живых клетках воспроизводимых и последовательным образом.
Кишечник C. elegans основных метаболических ткани в глистах и это регулятором важнейших системных гомеостаза и продолжительность жизни. Мы разработали анализов для оценки изменений в кислотности в просвет кишечника лизосомы червей, чтобы определить, как Лизосома опосредованной протеолиза способствует старению. Хотя рН чувствительных флуорофоров ранее использовались в C. elegans в ознаменование кишечных лизосомы, там еще не был попытке создать успешный протокол, который может обнаружить небольшое увеличение в лизосомальных рН в vivo18. Здесь мы предоставляем протокол, который может использоваться для определения потери лизосомальных кислотности в клетках кишечные нематоды Caenorhabditis elegans с помощью простой и удобный кормления протокол, который включает в себя рН чувствительных Флюорофор (cDCFDA) в ОР50 пищу.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разнообразные события на клеточном и молекулярном способствуют старения, под влиянием черты истории жизни и генетические факторы. Наши недавние исследования22 свидетельствует о том, что репродуктивный цикл играет важную роль в контроле фитнес Сома через регулирование ди?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить центр генетики Caenorhabditis штаммов, естественных наук и инженерных исследований Совета (СЕНТИ) и Канадский фонд инноваций (CFI) для финансирования. Мы хотели бы поблагодарить доктора Чена Lizhen (Департамент клетки систем и анатомии, UT здравоохранения Сан-Антонио) за предоставление неограниченного использования средств ее лаборатории для всех C. elegans экспериментов, а также Ванг Exing (заместитель директора, оптических изображений объекта UT здравоохранения Сан-Антонио) для помощи конфокальной микроскопии. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Майрона Игнатий за оказание поддержки и поощрение для облегчения снимать видео.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson’s disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?. Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington’s disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age?. Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
