Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis
Summary
Um guia passo a passo para sondar a perda da acidez dos lisossomos no intestino de c. elegans usando o corante vital sensíveis ao pH 6 – carboxi – 2′, 7′-diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)
Abstract
O nemátodo Caenorhabditis elegans (c. elegans) é um sistema de modelo que é amplamente utilizado para estudar a longevidade e os caminhos do desenvolvimento. Tais estudos são facilitados pela transparência do animal, a capacidade de transmitir e reverter ensaios genéticos, a relativa facilidade de gerar proteínas fluorescente etiquetadas e o uso de corantes fluorescentes que podem também ser injetadas no início embrião ou incorporados em seu alimento (e. coli estirpe OP50) para rotular organelas celulares (por exemplo, 9-dietilamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-1 e (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} – N – [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aqui, apresentamos o uso de um corante fluorescente de sensíveis ao pH que manchas lisossomos intestinais, fornecendo uma leitura visual de alterações fisiológicas, dinâmicas na acidez dos lisossomos em worms ao vivo. Este protocolo não mede pH dos lisossomos, mas prefiro visa estabelecer um método confiável de avaliação fisiológicas relevantes variações na acidez dos lisossomos. cDCFDA é um célula-permeant composto que é convertido para o fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) após hidrólise por esterases intracelulares. Protonação dentro de lisossomos armadilhas cDCF nestas organelas, onde se acumula. Devido a sua baixa pKa de 4.8, esse corante tem sido usado como um sensor de pH no fermento. Aqui nós descrevemos o uso de cDCFDA como suplemento alimentar para avaliar a acidez dos lisossomos intestinais em c. elegans. Esta técnica permite a detecção de lisossomos alcalinizante em animais vivos,, e tem uma ampla gama de aplicações experimentais, incluindo estudos sobre envelhecimento, autofagia e biogênese dos lisossomos.
Introduction
A aparência de agregados de proteínas é amplamente aceito para ser uma marca registrada de envelhecimento em pilhas eukaryotic1,2,3e a formação do que é pensado para estar entre os condutores de princípio da senescência celular4 , 5 , 6 , 7. há evidência crescente que, como células de idade catabolismo proteico é prejudicado, levando a um aumento na agregação da proteína. O colapso da proteólise em células de envelhecimento envolve uma imparidade de autofagia8 , bem como a degradação de proteínas mediada por Proteassoma9. Finalmente, oxidação de proteínas irreversível é aumentada em células velhas, prejudicando ainda mais o catabolismo de proteína10.
Autofagia foi inicialmente pensada para ser um processo não-seletivo para degradação em massa de proteínas danificadas, mas estudos recentes têm indicado que autofagia é altamente seletiva para o catabolismo de agregados de proteínas e organelas disfuncionais que não são passível de degradação através de de mecanismos de autorização outros proteína11. Durante o processo de autofagia, proteínas danificadas e agregadas são isoladas em uma vesícula de dupla membrana chamada o autophagosome. Este autophagosome então funde-se com as organelas ácidas chamadas lisossomos, o que leva à degradação do autophagosome carga12. Lisossomos representam o ponto de extremidade da via autophagic e participarem de diferentes processos celulares, tais como a reparação da membrana, controle transcricional e detecção de nutrientes; destacando seu papel centralizado na homeostase celular (revisto em ref. 13). Vários estudos têm demonstrado uma associação entre uma redução dependente da idade na função dos lisossomos e várias de doenças neurodegenerativas13. Consistentemente, restaurando a função dos lisossomos em células mais velhas pode retardar o aparecimento de fenótipos relacionadas ao envelhecimento14,15. Estudos da composição do meio de intralumen sugerem que o colapso da função dos lisossomos em células mais velhas não é devido a uma redução na produção de proteases lisossomais16. Como alternativa, tem sido proposto que perda da acidez intralysosomal, um requisito fundamental da sua actividade enzimática, pode fundamentam a diminuição da proteólise mediada por lisossoma17. Para ser capaz de explorar essa hipótese, é essencial desenvolver protocolos para sondar mudanças dinâmicas no pH dos lisossomos em células vivas de uma forma consistente e replicável e reagentes.
O intestino de c. elegans é o principal tecido metabólico em worms e é um crítico regulador da homeostase sistêmica e vida útil. Temos desenvolvido ensaios para avaliar alterações na acidez do lúmen de lisossomos intestinais de worms para determinar como mediada por lisossoma proteólise contribui para o envelhecimento. Embora sensíveis ao pH fluorophores têm sido utilizados anteriormente em c. elegans para marcar lisossomos intestinais, ainda não houve um esforço para estabelecer um protocolo bem sucedido que pode detectar pequenos aumentos no pH dos lisossomos na vivo18.. Aqui, nós fornecemos um protocolo que pode ser usado para detectar a perda da acidez dos lisossomos em células intestinais de c. elegans usando um protocolo de alimentação simples e conveniente que incorpora um fluoróforo sensíveis ao pH (cDCFDA) OP50 comida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma variedade de eventos celulares e moleculares contribuem para o envelhecimento, influenciado pela história de vida características e fatores genéticos. Nosso recente estudo22 sugere que o ciclo reprodutivo desempenha um papel importante no controle da aptidão da soma através da regulamentação da dinâmica dos lisossomos pH. Nós mostramos que a proteólise lisossomal mediada é promovido enquanto animais reproduzem-se ativamente por upregulation de transcrição v-ATPase, que por sua vez…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o centro de genética Caenorhabditis para tensões, as ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia (NSERC) e a Fundação do Canadá para a inovação (TPI) para financiamento. Gostaríamos de agradecer o Dr. Lizhen Chen (departamento de sistemas de célula e anatomia, UT saúde San Antonio) por permitir o uso irrestrito de seus laboratórios para todos os experimentos de c. elegans , bem como Dr. Exing Wang (diretor associado, Optical Imaging Facility UT saúde San Antonio) para obter assistência com microscopia confocal. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Myron Ignatius para fornecer apoio e incentivo para facilitar a gravação do vídeo.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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