Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans
Summary
Una guida dettagliata per sondare la perdita di acidità lysosomal nell’intestino di c. elegans usando il colorante vitale sensibili al pH 6 – carboxy – 2′, 7′-diclorofluoresceina diacetato (cDCFDA)
Abstract
Il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) è un sistema di modello che è ampiamente usato per studiare la longevità e le vie dello sviluppo. Tali studi sono facilitati dalla trasparenza dell’animale, la capacità di avanti e indietro le analisi genetiche, la relativa facilità di generare proteine fluorescente contrassegnati e l’uso di coloranti fluorescenti che possono sia essere microiniettati in anticipo embrione o incorporati in suo cibo (e. coli ceppo OP50) per etichettare gli organelli cellulari (ad es. 9-diethylamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-one e (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN} – N – [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Qui, presentiamo l’uso di un colorante fluorescente pH sensibili che macchie intestinali lisosomi, fornendo una lettura visiva dei cambiamenti dinamici, fisiologici acidità lisosomiale in vermi vivi. Questo protocollo non misurare pH lisosomiale, ma piuttosto mira a stabilire un metodo affidabile di valutazione fisiologiche varianti pertinenti lysosomal acidità. cDCFDA è un cellulare-permeante composto che viene convertito il fluoroforo fluorescente 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) su idrolisi dalle esterasi intracellulari. Protonazione all’interno dei lisosomi trappole cDCF in questi organelli, dove si accumula. A causa del suo basso pKa di 4.8, questo colorante è stato utilizzato come un sensore di pH in lievito. Qui descriviamo l’uso di cDCFDA come integratore alimentare per valutare l’acidità dei lisosomi intestinali in elegans del c. Questa tecnica consente il rilevamento dei lisosomi alcalinizzante in animali vivi, e ha una vasta gamma di applicazioni sperimentali tra cui studi sull’invecchiamento, autophagy e biogenesi lisosomiale.
Introduction
L’aspetto di aggregati proteici ampiamente è accettato per essere un marchio di garanzia di invecchiamento in cellule eucariotiche1,2,3e la formazione di cui è pensato per essere tra i piloti di principio di senescenza cellulare4 , 5 , 6 , 7. sta coltivando la prova che come cellule età, catabolismo proteico è alterato, portando ad un aumento di aggregazione proteica. Il crollo di proteolisi in cellule di invecchiamento comporta un danno dell’autofagia8 , così come di degradazione proteasome-mediata della proteina9. Infine, ossidazione irreversibile della proteina è aumentata in cellule vecchie, compromettendo ulteriormente proteina catabolismo10.
L’autofagia è stato inizialmente pensato per essere un processo non-selettivi per la degradazione della massa di proteine danneggiate, ma recenti studi hanno indicato che l’autofagia è altamente selettivo per il catabolismo di aggregati di proteine e organelli disfunzionali che non sono suscettibili di degradazione tramite altri meccanismi di clearance proteina11. Durante il processo di autofagia, proteine danneggiate e aggregate sono sequestrate in una vescicola di doppia membrana chiamata autofagosoma. Quindi questo autofagosoma si fonde con gli acidi organelli chiamati lisosomi, che porta alla degradazione dell’autofagosoma carico12. I lisosomi rappresentano il punto finale del pathway autofagico e partecipano a diversi processi cellulari come la riparazione della membrana, controllo trascrizionale e rilevamento dei nutrienti; evidenziando il loro ruolo centralizzato nell’omeostasi cellulare (rivisto in rif. 13). Parecchi studi hanno indicato un’associazione tra una diminuzione età-dipendente nella funzione lisosomiale e vari disordini di neurodegenerative13. Coerentemente, ristabilimento della funzione lysosomal in cellule anziani può ritardare l’insorgenza di relazione con l’invecchiamento fenotipi14,15. Gli studi della composizione del milieu mancata suggeriscono che il collasso della funzione lysosomal in cellule anziani non è a causa di una riduzione della produzione di proteasi lisosomiali16. In alternativa, è stato proposto che perdita di acidità intralysosomal, un requisito fondamentale della sua attività enzimatica, può essere alla base il calo di proteolisi lisosoma-mediata17. Per essere in grado di esplorare questa ipotesi, è essenziale sviluppare reagenti e protocolli per sondare i cambiamenti dinamici nel pH lisosomiale in cellule vive in maniera coerenza e replicabile.
L’intestino di c. elegans è il tessuto metabolico principale in viti senza fine ed è un regolatore critico dell’omeostasi sistemica e durata della vita. Abbiamo sviluppato saggi per valutare i cambiamenti dell’acidità del lume intestinali lisosomi di vermi per determinare come lisosoma-mediata proteolisi contribuisce all’invecchiamento. Anche se fluorofori pH sensibili sono stati usati precedentemente in c. elegans per contrassegnare i lisosomi intestinali, ci non è stato ancora uno sforzo per stabilire un protocollo di successo in grado di rilevare piccoli aumenti in pH lisosomiale in vivo18. Qui, forniamo un protocollo che può essere utilizzato per rilevare la perdita di acidità lisosomiale nelle cellule intestinali di c. elegans utilizzando un protocollo di alimentazione semplice e conveniente che incorpora un fluoroforo pH sensibili (cDCFDA) in OP50 cibo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una varietà di eventi cellulari e molecolari contribuiscono all’invecchiamento, influenzato da tratti di storia di vita e fattori genetici. Nostro recente studio22 suggerisce che il ciclo riproduttivo svolge un ruolo importante nel controllare l’idoneità del soma attraverso la regolazione della dinamica di pH lisosomiale. Abbiamo mostrato che proteolisi lisosomiale-mediata sono promosso mentre gli animali si riproducono attivamente dal upregulation della trascrizione del v-atpasi, che a sua volt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il centro di genetica di Caenorhabditis per i ceppi, le scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC) e la Fondazione canadese per l’innovazione (CFI) per il finanziamento. Vorremmo ringraziare Dr. Lizhen Chen (dipartimento di sistemi cellulari e anatomia, UT Salute San Antonio) per consentire l’utilizzo illimitato del suoi attrezzature di laboratorio per tutti gli esperimenti di c. elegans , nonché Exing Dr. Wang (direttore associato, Optical Imaging Facility UT Salute San Antonio) per assistenza con la microscopia confocale. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Myron Ignatius per fornire supporto e incoraggiamento per facilitare le riprese video.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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