הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans
Summary
מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור אובדן של חומציות lysosomal במעי של C. elegans באמצעות לצבוע חיוני רגיש pH 5 (6) – carboxy – 2′, 7′-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)
Abstract
תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא מערכת מודל זה נעשה שימוש נרחב ללמוד אריכות ימים מסלולים התפתחותית. מחקרים כאלה מתבצעים על ידי השקיפות של החיה, היכולת להעביר ולהפוך מבחני גנטי, הקלות היחסית ביצירת החלבונים fluorescently שכותרתו, השימוש של צבעי פלורסנט, זה גם יכול להיות microinjected לתוך המוקדמת העובר או שולבו אוכל שלה (e. coli זן OP50) כדי להדביק תווית organelles הסלולר (למשל 9-diethylamino-5 שעות-benzo (א) phenoxazine-5-1 ו (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} – N – [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). כאן, אנו מציגים את השימוש ה-pH רגיש הפלורסנט זה כתמים lysosomes מעיים, מתן של הבדיקה חזותית של שינויים דינמיים, פיזיולוגיים של חומציות lysosomal תולעים בשידור חי. פרוטוקול זה לא למדוד lysosomal pH, אבל מעדיף שואפת להקים שיטה אמינה של הערכת פיזיולוגיים וריאציות הרלוונטיים ב lysosomal חומציות. cDCFDA הוא תרכובת תא-permeant המרת ניאון fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) על הידרוליזה על ידי תאיים esterases. פרוטונציה בתוך lysosomes מבצע השמנה cDCF ב organelles האלה, איפה זה מצטבר. עקב pKa שלה נמוכה של 4.8, צבע זה שימש חיישן ה-pH של שמרים. כאן נתאר את השימוש cDCFDA כתוספת מזון כדי להעריך את החומציות במעיים lysosomes ב C. elegans. טכניקה זו מאפשרת איתור lysosomes alkalinizing בבעלי חיים, , יש מגוון רחב של יישומים ניסיונית כולל מחקרים על הזדקנות autophagy, lysosomal להן.
Introduction
המראה של אגרגטים חלבון מקובל להיות סימן היכר של הזדקנות התאים האיקריוטים1,2,3, היווצרות אשר נחשבת בקרב הנהגים עיקרון של הזדקנות ביולוגית הסלולר4 , 5 , 6 , 7. גדל ראיות כי כמו תאים גיל, פירוק חלבון פגום, מובילה לעלייה צבירת חלבון. נפילת proteolysis ב הזדקנות תאים כרוך ליקוי autophagy8 , כמו גם חלבון בתיווך פרוטאוזום השפלה9. לבסוף, חמצון החלבון בלתי הפיך הוא גדל בתאים הישנים, בהמשך ופוגע קטבוליזם חלבון10.
Autophagy. בהתחלה חשבו להיות תהליך לא בררניים עבור השפלה בכמות גדולה של חלבונים פגומים, אבל מחקרים אחרונים הראו ש-autophagy הזה הוא סלקטיבי מאוד קטבוליזם של אגרגטים חלבון לקוי organelles שאינם נוטה השפלה באמצעות מנגנוני אישור11האחרים חלבון. במהלך התהליך של autophagy, חלבונים פגומים, צבורים הן מבודדות לתוך שלפוחית כפול-הממברנה קרא את autophagosome. ואז, autophagosome הזה בין עם organelles חומצי בשם lysosomes, אשר מוביל השפלה של מטענים autophagosome12. Lysosomes מייצגים את מובילים של הנתיב autophagic ולהשתתף תהליכים תאיים שונים כגון תיקון קרום, בקרת גנים ברמת השעתוק חישה מזין; הדגשת תפקידם מרוכזת של הומאוסטזיס הסלולר (שבתוך הפניה למעורר 13). מספר מחקרים הראו אסוציאציה בין תלויי-גיל ירידה בתפקוד lysosomal הפרעות ניווניות שונות13. באופן עקבי, שחזור פונקציה lysosomal בתאים בוגרים יכולים לעכב את התחלתה של זיקנה פנוטיפים14,15. מחקרים של ההרכב של הסביבה שבה התרחשה intralumen מראים כי קריסת פונקציית lysosomal תאים בוגרים אינה עקב ירידה בייצור של פרוטאזות lysosomal16. לחלופין, שהוא הוצע כי אובדן intralysosomal חומציות, דרישה קריטי של פעילותה אנזימטיות, עשויה ביסוד ירידה בתיווך ליזוזום proteolysis17. כדי שתוכל לחקור את השערה זו, זה חיוני לפתח נוגדנים ופרוטוקולים כדי לחקור דינאמי לשינויים lysosomal pH של תאים חיים בצורה עקבית לשכפול.
המעי של C. elegans הוא הרקמה חילוף החומרים העיקריים בעיר וורמס וזה מווסת קריטי של הומאוסטזיס מערכתית ואת תוחלת החיים. פיתחנו מבחני להעריך את השינויים בהחומציות של לומן של lysosomes מעיים של תולעים כדי לקבוע כיצד בתיווך ליזוזום proteolysis תורמת להזדקנות. למרות fluorophores pH רגיש שימשו בעבר C . elegans כדי לסמן lysosomes מעיים, לא עוד היה מאמץ כדי לבסס פרוטוקול מוצלח שיכול לזהות עליות קטנות ב- lysosomal pH ויוו18. כאן, אנו מספקים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות אובדן של חומציות lysosomal בתאים מעיים של C. elegans באמצעות פרוטוקול האכלה פשוטה ונוחה המשלבת של pH רגיש fluorophore (cDCFDA) למזון OP50.
Protocol
Representative Results
Discussion
מגוון רחב של אירועים תאית ומולקולרית לתרום הזדקנות, מושפע תכונות היסטוריית החיים וגורמים גנטיים. המחקר האחרון שלנו22 מרמז כי מחזור הרבייה ממלא תפקיד חשוב בשליטה על הכושר של סומא באמצעות ויסות lysosomal pH dynamics. הראנו שאת proteolysis lysosomal בתיווך הוא קידם בעוד חיות להתרבות באופן פעיל על י?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למרכז גנטיקה Caenorhabditis זנים, מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), קרן קנדה עבור חדשנות (CFI) למימון. ברצוננו להודות ד ר ליזהן חן (החוג למערכות תא ו אנטומיה, UT בריאות סן אנטוניו) עבור המאפשר שימוש בלתי מוגבל של מתקני המעבדה שלה עבור כל הניסויים C. elegans , כמו גם ד ר וואנג Exing (מנהל שותף, מתקן הדמיה אופטית UT בריאות סן אנטוניו) לקבלת סיוע עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו רוצים גם תודה ד ר מירון איגנטיוס למתן תמיכה ועידוד כדי להקל את. הצילומים.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson’s disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?. Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington’s disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age?. Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
