Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans
Summary
Eine schrittweise Anleitung zum Verlust der lysosomalen Säure im Darm von C. Elegans mit der pH-Sensitive vital Farbstoff 6 – Carboxy – 2′, 7′-dichlorofluoresceins Diacetat (cDCFDA) Sonde
Abstract
Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) ist ein Modell, das häufig verwendet wird, um Langlebigkeit und Entwicklungsstörungen Wege zu studieren. Solche Studien werden erleichtert durch die Transparenz des Tieres, die Fähigkeit, weiterleiten und umkehren, genetische Tests, die relative Leichtigkeit der Generierung von eindringmittel markierte Proteine und die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die entweder in den frühen mikroinjiziert werden können Embryo oder integriert in seine Nahrung (E. Coli -Stamm OP50) zellulare Organellen (z.B. 9-Diethylamino-5 H-Benzo (a) Phenoxazine-5-1 und (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) Methylidene]-2 H-Pyrrol-5-Yl-KappaN} – N – beschriften [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Hier präsentieren wir Ihnen die Verwendung von einem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff, der Darm Lysosomen Flecken bietet eine visuelle Auslesen der dynamischen, physiologische Veränderungen in lysosomalen Säure im Leben Würmer. Dieses Protokoll misst nicht lysosomale pH-Wert, sondern vielmehr soll eine zuverlässige Methode zur Beurteilung relevanten physiologischen Variationen in lysosomalen Säure. cDCFDA ist eine Zelle-permeationsfähigen Substanz, die in den fluoreszierenden Fluorophor 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) nach Hydrolyse von intrazellulären Esterasen umgewandelt wird. Protonierung in Lysosomen fallen cDCF in diese Organellen, wo es sich ansammelt. Aufgrund seiner niedrigen pKa von 4,8 wurde dieser Farbstoff als pH-Sensor in der Hefe verwendet. Hier beschreiben wir die Verwendung von cDCFDA als Nahrungsergänzungsmittel zu beurteilen, den Säuregehalt des intestinalen Lysosomen in C. Elegans. Diese Technik ermöglicht die Erkennung von alkalisierenden Lysosomen mit lebenden Tieren, und hat ein breites Anwendungsspektrum experimentelle Studien über das Altern, Autophagie und lysosomale Biogenese einschließlich.
Introduction
Das Erscheinungsbild von proteinaggregaten ist weithin anerkannt, zu einem Markenzeichen des Alterns in eukaryotischen Zellen1,2,3, und die Bildung von denen angenommen wird, unter den Fahrern Prinzip der zellulären Seneszenz4 , 5 , 6 , 7. es gibt zunehmend Beweise wie Alter Zellen, PROTEINKATABOLISMUS, führt zu einem Anstieg der Proteinaggregation vorliegt. Der Zusammenbruch der Proteolyse in alternden Zellen beinhaltet eine Beeinträchtigung der Autophagie8 sowie Proteasom-vermittelten Protein Degradation9. Schließlich wird irreversibel Protein Oxidation in alten Zellen erhöht Protein Katabolismus10weiter zu beeinträchtigen.
Autophagie wurde ursprünglich gedacht, um ein nicht-selektiven Verfahren zur Masse Abbau von beschädigten Proteinen, aber neuere Studien haben gezeigt, dass Autophagie ist sehr selektiv zu den Katabolismus von Protein-Aggregate und dysfunktionalen Organellen, die nicht Abbau über andere Protein-Clearance Mechanismen11zugänglich. Während des Prozesses der Autophagie sind beschädigt und aggregierte Proteine in einer Doppel-Membran Vesikel genannt die Autophagosome abgesondert. Dieser Autophagosome verschmilzt dann mit der sauren Organellen genannt Lysosomen, die führt zu einer Verschlechterung der Autophagosome Ladung12. Lysosomen repräsentieren den Endpunkt des selbstverdauende Weges und verschiedene zelluläre Prozesse wie Membran Reparatur, transcriptional Control und Nährstoff sensing beteiligt; Hervorhebung ihrer zentralen Rolle in zelluläre Homöostase (überarbeitet in Nr. 13). Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen einer altersabhängige Rückgang der lysosomalen Funktion und verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen13gezeigt. Konsequent, kann Wiederherstellung der lysosomalen Funktion in älteren Zellen alterungsbedingte Phänotypen14,15verzögern. Studien der Komposition des Intralumen Milieus deuten darauf hin, dass der Zusammenbruch der lysosomalen Funktion in älteren Zellen nicht durch einen Rückgang der Produktion von lysosomale Proteasen16. Alternativ wurde vorgeschlagen, dass Verlust der Intralysosomal Säure, eine entscheidende Voraussetzung für seine enzymatische Aktivität, den Rückgang der Lysosomen-vermittelten Proteolyse17zugrunde liegen kann. Um diese Hypothese zu erkunden zu können, ist es entscheidend für die Entwicklung von Reagenzien und Protokolle, dynamische Veränderung des lysosomalen pH-Wertes in lebenden Zellen in eine reproduzierbare und konsistente Weise zu erforschen.
Der Darm von C. Elegans ist das große metabolische Gewebe in Worms und es ist eine kritische Regulator des systemischen Homöostase und Lebensdauer. Haben wir Tests zur Beurteilung von Veränderungen in der Säure des Lumens der intestinalen Lysosomen von Worms um festzustellen, wie Lysosomen-vermittelten Proteolyse trägt zur Alterung. Wenn pH-Sensitive Fluorophore zuvor in C. Elegans verwendet wurden, um intestinale Lysosomen zu markieren, wurde es noch keinem bemühen, eine erfolgreiche Protokoll zu etablieren, die kleine Erhöhungen in lysosomalen pH-Wert in Vivo18. erkennen kann Hier bieten wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um Verlust der lysosomalen Säure in die Darmzellen von C. Elegans zu erkennen, über eine einfache und bequeme Fütterung Protokoll, die einen pH-Sensitive Fluorophor (cDCFDA) enthält in OP50 Nahrung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Vielzahl von zellulären und molekularen Ereignissen trägt zum Altern, von Lebensgeschichte Merkmale und genetische Faktoren beeinflusst. Unsere aktuelle Studie22 legt nahe, dass die reproduktive Zyklus eine wichtige Rolle spielt bei der Kontrolle der Fitness von Soma durch die Regulierung der lysosomalen pH Dynamik. Wir zeigten, dass dieser lysosomalen vermittelte Proteolyse gefördert wird, während Tiere aktiv reproduzieren durch Hochregulation von V-ATPase Transkription, sorgt wiederum f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Caenorhabditis Genetik Zentrum für Stämme, die Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC) und Canada Foundation für Innovation (CFI) für die Finanzierung. Wir möchten danken Dr. Lizhen Chen (Abteilung Zellsysteme und Anatomie, UT Gesundheit San Antonio) dafür, dass die uneingeschränkte Nutzung der ihr Laboreinrichtungen für alle C. Elegans Experimente sowie Dr. Exing Wang (Associate Director, Optical Imaging Facility UT Health San Antonio) Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir möchten auch Dr. Myron Ignatius danken für die Unterstützung und Ermutigung für den Videodreh zu erleichtern.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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