Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l' intestin de vivre Caenorhabditis elegans
Summary
Un guide étape par étape pour sonder la perte d’acidité lysosomale dans l’intestin c. elegans en utilisant le colorant vital sensibles au pH 6 – carboxy – 2′, 7′-dichlorofluorescéine diacétate (cDCFDA)
Abstract
Le nématode Caenorhabditis elegans (c. elegans) est un système de modèle qui est largement utilisé pour étudier la longévité et les voies de développement. Ces études sont facilitées par la transparence de l’animal, la possibilité de d’avance et de retour des tests génétiques, la facilité relative de la production de protéines fluorescent étiquetés et l’utilisation des colorants fluorescents qui peut soit être micro dans le début embryon ou incorporés dans sa nourriture (e. coli de souche OP50) d’étiqueter les organites cellulaires (par exemple 9-diéthylamino-5 H-benzo [a] Phénoxazine-5 et la (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) disodique]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} – N – [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Nous présentons ici l’utilisation d’un colorant fluorescent de sensibles au pH qui taches intestinales lysosomes, fournissant une lecture visuelle de la dynamique des changements physiologiques en acidité lysosomale en direct vers. Ce protocole ne mesure pas pH lysosomal, mais vise plutôt à établir une méthode fiable d’évaluation des variations physiologiques importantes en acidité lysosomale. cDCFDA est un composé cellulaire perméable qui est converti en fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) après hydrolyse par les estérases intracellulaires. Protonation à l’intérieur des lysosomes des pièges cDCF dans ces organites, où il s’accumule. En raison de sa faible pKa de 4,8, ce colorant a été utilisé comme un capteur de pH dans la levure. Nous décrivons ici l’utilisation de cDCFDA comme un complément alimentaire afin d’évaluer l’acidité des lysosomes intestinales dans c. elegans. Cette technique permet la détection des lysosomes alcalinisants animaux vivants,, et a une large gamme d’applications expérimentales, notamment des études sur le vieillissement, autophagie et biogenèse lysosomale.
Introduction
L’apparition d’agrégats de protéines est largement reconnue pour être une caractéristique du vieillissement dans les cellules eucaryotes1,2,3et la formation dont est pensé pour être parmi les pilotes de principe de sénescence cellulaire4 , 5 , 6 , 7. il n’y a plus de preuves que, comme l’âge des cellules, catabolisme protéique est altérée, conduisant à une augmentation dans l’agrégation des protéines. L’effondrement de la protéolyse dans le vieillissement des cellules implique une déficience de l’autophagie8 ainsi que la dégradation de protéine induite par le protéasome9. Enfin, oxydation irréversible de protéines est augmentée dans les anciennes cellules, outre une atteinte de catabolisme de protéine10.
Autophagie était initialement considéré comme un processus non sélectif pour la dégradation de la majeure partie des protéines endommagées, mais des études récentes indiquent que l’autophagie est hautement sélective pour le catabolisme des agrégats de protéine et dysfonctionnels organites qui ne sont pas se prêtent à la dégradation par d’autres protéines clairance mécanismes11. Au cours du processus de l’autophagie, protéines endommagées et agrégées sont séquestrés dans une vésicule double membrane appelée l’autophagosome. Cette autophagosome fusionne alors avec les organites acides appelés lysosomes, qui conduit à la dégradation de l’autophagosome fret12. Lysosomes représentent l’aboutissement de la voie de l’autophagie et participent aux différents processus cellulaires tels que la réparation de la membrane, contrôle transcriptionnel et détection des éléments nutritifs ; mettant en évidence leur rôle central dans l’homéostasie cellulaire (examinée par Réf. 13). Plusieurs études ont montré une association entre une diminution de la fonction de l’âge en fonction lysosomale et divers de troubles neurodégénératifs13. Constamment, le fait de restaurer une fonction lysosomale dans les cellules plus âgées peut retarder l’apparition de phénotypes liés au vieillissement14,15. Étude de la composition du milieu intralumen suggère que l’effondrement de la fonction lysosomale dans les cellules plus âgées n’est pas due à une diminution de la production de protéases lysosomales16. Par ailleurs, il a été proposé que la perte d’acidité intralysosomal, une exigence essentielle de l’activité enzymatique, pourrait expliquer la baisse induite par le lysosome protéolyse17. Pour être en mesure d’explorer cette hypothèse, il est essentiel de développer des réactifs et protocoles pour sonder les variations dynamiques de pH lysosomal dans des cellules vivantes de manière reproductible et cohérente.
L’intestin de c. elegans est un tissu métabolique majeur à worms et c’est un critique régulateur de l’homéostasie systémique et de la durée de vie. Nous avons développé des tests pour évaluer les changements de l’acidité de la lumière des lysosomes intestinales de worms pour déterminer comment le lysosome-mediated protéolyse contribue au vieillissement. Bien que sensibles au pH fluorophores ont été utilisés auparavant chez c. elegans pour marquer les lysosomes intestinales, il n’y a encore un effort pour établir un protocole de succès qui peut de détecter de faibles hausses en pH lysosomal en vivo18. Ici, nous fournissons un protocole qui peut être utilisé pour détecter la perte d’acidité lysosomale dans les cellules intestinales de c. elegans en utilisant un protocole alimentaire simple et pratique qui intègre un fluorophore sensibles au pH (cDCFDA) dans la nourriture OP50.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une variété d’événements cellulaires et moléculaires contribuent au vieillissement, influencé par les caractéristiques du cycle vital et de facteurs génétiques. Notre récente étude22 suggère que le cycle de la reproduction joue un rôle important dans le contrôle de l’aptitude du soma en régulant la dynamique pH lysosomal. Nous avons montré que cette protéolyse médiée par les lysosomes est encouragée tandis que les animaux se reproduire activement par l’augmentation de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le centre de génétique de Caenorhabditis pour les souches, les Sciences naturelles et Conseil de recherches en génie (CRSNG) et la Fondation canadienne pour l’Innovation (FCI) pour le financement. Nous tenons à remercier le professeur Lizhen Chen (département des systèmes cellulaire et anatomie, UT santé San Antonio) pour permettre l’utilisation sans restrictions de ses installations de laboratoire pour toutes les expériences de c. elegans comme Dr Exing Wang (directeur associé, Centre d’imagerie optique UT santé San Antonio) d’assistance avec la microscopie confocale. Nous tenons également à remercier le Dr Myron Ignatius pour fournir soutien et encouragement pour faciliter le tournage vidéo.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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