Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans
Summary
Een stapsgewijze handleiding sonde verlies van lysosomale zuurtegraad in de darm van C. elegans met behulp van de pH-gevoelige vitale kleurstof 5 (6) – carboxy – 2′, 7′-dichlorofluorescein-DIACETAAT (cDCFDA)
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een modelsysteem dat veel gebruikt wordt om te studeren, lange levensduur en ontwikkelings trajecten. Dergelijke studies worden gefaciliteerd door de transparantie van het dier, de mogelijkheid om te vooruit en achteruit genetische tests, het relatieve gemak van genereren fluorescently geëtiketteerde eiwitten, en het gebruik van fluorescente kleurstoffen die kan worden microinjected in de vroege embryo of opgenomen in zijn voedsel (E. coli stam OP50) op het etiket van cellulaire organellen (bijvoorbeeld 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-één en (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} – N – [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Hier presenteren we het gebruik van een fluorescente kleurstof van pH-gevoelige die vlekken intestinale lysosomen, voorzien van een visuele uitlezing van dynamische, fysiologische veranderingen in lysosomale zuurgraad in levende wormen. Dit protocol niet lysosomale pH meet, maar wil liever een betrouwbare methode voor de beoordeling van de fysiologische relevante varianten in lysosomale zuurgraad. cDCFDA is een cel-permeant verbinding die wordt geconverteerd naar de fluorescerende fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) na hydrolyse door intracellulaire esterasen. Protonering binnen lysosomen overlapt cDCF in deze organellen, waar het zich ophoopt. Als gevolg van zijn lage pKa van 4.8, is deze kleurstof gebruikt als een pH sensor in gist. Hier beschrijven we het gebruik van cDCFDA als een voedingssupplement te beoordelen van de zuurgraad van intestinale lysosomen in C. elegans. Deze techniek zorgt voor de detectie van alkalinizing lysosomen in levende dieren in, en heeft een breed scala van experimentele toepassingen met inbegrip van studies over autophagy, veroudering en lysosomale biogenese.
Introduction
Het uiterlijk van eiwit-aggregaten is algemeen aanvaard als een kenmerk van veroudering in eukaryote cellen1,2,3, en de vorming van die wordt beschouwd als onder de bestuurders van het principe van cellulaire senescentie4 , 5 , 6 , 7. er zijn steeds meer aanwijzingen dat leeftijd cellen, eiwit katabolisme bijzondere waardevermindering heeft ondergaan is, wat leidt tot een toename van de aggregatie van eiwitten. De ineenstorting van proteolyse in de veroudering van de cellen impliceert een bijzondere waardevermindering van autophagy8 evenals proteasoom-gemedieerde eiwit afbraak9. Ten slotte, onomkeerbare eiwit oxidatie wordt verhoogd in oude cellen, verder afbreuk te doen aan eiwit katabolisme10.
Autophagy was in eerste instantie dacht dat een niet-selectieve proces voor bulk afbraak van beschadigde eiwitten, maar recente studies hebben aangegeven dat autophagy is zeer selectief aan het katabolisme van eiwit-aggregaten en disfunctionele organellen die niet vatbaar voor afbraak via andere eiwit klaring mechanismen11. Tijdens het proces van autophagy, zijn beschadigde en geaggregeerde eiwitten afgezonderd in een dubbel-membraan blaasje genaamd de autophagosome. Dit autophagosome vervolgens combineert met de zure organellen genaamd lysosomen, die leidt tot aantasting van de lading autophagosome12. Lysosomen vertegenwoordigen het eindpunt van het autophagic traject en deelnemen aan verschillende cellulaire processen zoals membraan reparatie, transcriptionele controle en nutriënten sensing; markeren hun centrale rol in de cellulaire homeostase (herzien in ref. 13). Verschillende studies hebben een associatie tussen een leeftijd afhankelijke daling in lysosomale functie en verschillende neurodegeneratieve aandoeningen13aangetoond. Consequent, kan herstel van de lysosomale functie in oudere cellen vertragen het ontstaan van veroudering-gerelateerde fenotypen14,15. Studies van de samenstelling van de intralumen kring suggereren dat de ineenstorting van de lysosomale functie in oudere cellen niet te wijten aan een vermindering van de productie van lysosomale proteasen16 is. Er wordt ook geopperd dat verlies van intralysosomal zuurgraad, een kritieke eis van de enzymatische activiteit, de daling lysosoom-gemedieerde proteolyse17ten grondslag kan liggen. Om te kunnen verkennen deze hypothese, is het essentieel om reagentia en protocollen om te sonderen dynamische veranderingen in lysosomale pH in levende cellen in een repliceerbare en consistente manier te ontwikkelen.
De darm van C. elegans is het belangrijke metabole weefsel in wormen en is een kritische regelgever van systemische homeostase en levensduur. Hebben we testen om te evalueren van de veranderingen in de zuurgraad van het lumen van de darm lysosomen van wormen om te bepalen hoe lysosoom-gemedieerde proteolyse bijdraagt aan veroudering. Hoewel pH-gevoelige fluorophores hebben eerder is gebruikt in C. elegans om te markeren van intestinale lysosomen, is er nog niet een poging om een succesvolle protocol dat kleine stijgingen in lysosomale pH in vivo18. detecteren kan Wij bieden hier, een protocol dat kan worden gebruikt voor het detecteren van verlies van lysosomale zuurgraad in de intestinale cellen van C. elegans met behulp van een eenvoudige en handige voeding protocol waarin een pH-gevoelige fluorophore (cDCFDA) in OP50 voedsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een verscheidenheid van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen bijdragen aan veroudering, beïnvloed door levensgeschiedenis karaktertrekken en genetische factoren. Onze recente studie22 suggereert dat de reproductieve cyclus een belangrijke rol speelt bij de controle van de geschiktheid van het soma door middel van de verordening van lysosomale pH dynamiek. We toonden dat lysosomal-gemedieerde proteolyse wordt bevorderd terwijl dieren actief reproduceren door opregulatie van v-ATPase transcript…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken het Caenorhabditis genetica Center for stammen, the Natural Sciences and Engineering Research Raad (NSERC), en de Stichting van Canada voor innovatie (CFI) voor financiering. Wij zouden graag willen bedanken Dr. Lizhen Chen (departement van Cell Systems en anatomie, UT gezondheid San Antonio) voor het toestaan van onbeperkt gebruik van haar lab voorzieningen voor alle C. elegans experimenten evenals Dr. Exing Wang (Associate Director, optische Imaging faciliteit UT gezondheid San Antonio) voor hulp bij confocale microscopie. Ook bedank we Dr Myron Ignatius voor het verstrekken van steun en aanmoediging om de video-shoot.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson’s disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?. Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington’s disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age?. Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
