تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس
Summary
دليل خطوة بخطوة للتحقيق في فقدان الليزوزومية الحموضة في الأمعاء من C. ايليجانس استخدام صبغة حساسة لدرجة الحموضة الحيوية 6-كاربوكسي-2 ‘، اسيتات 7’-ديتشلوروفلوريسسين (كدكفدا)
Abstract
ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) هو نموذج نظام الذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة طول العمر والمسارات الإنمائية. ومما ييسر هذه الدراسات شفافية الحيوان، والقدرة على توجيه وعكس الاختبارات الجينية، والسهولة النسبية لتوليد البروتينات المسماة فلوريسسينتلي، واستخدام الأصباغ الفلورية التي يمكن أما أن يكون ميكروينجيكتيد في وقت مبكر الجنين أو إدماجه في غذائها (سلالةكولاي OP50) لتسمية العضيات الخلوية (مثلاً 9-ديثيلامينو-ح 5-بنزو (أ) فينوكسازيني-5-واحد و (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) ميثيليديني] ح-2-بيرل-5-يل-كابان}-N- [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). هنا، نحن نقدم استخدام صبغة حساسة لدرجة الحموضة الفلورسنت البقع lysosomes المعوية، توفير قراءات بصرية للتغيرات الفسيولوجية، ودينامية في الحموضة الليزوزومية في الديدان الحية. هذا البروتوكول ليس قياس درجة الحموضة الليزوزومية، ولكن بدلاً من ذلك يهدف إلى وضع طريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم التغيرات ذات الصلة الفسيولوجية في الحموضة الليزوزومية. كدكفدا هو مركب بيرمينت خلية التي يتم تحويلها إلى نيون فلوروفوري 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (تتيح) عند التحلل من استيراسيس داخل الخلايا. بروتونيشن داخل lysosomes الفخاخ تتيح في هذه العضيات، حيث يتراكم. وقد استخدمت هذه الصبغة سبب لها pKa منخفضة من 4.8، كجهاز استشعار درجة حموضة في الخميرة. هنا يصف لنا باستخدام كدكفدا كمكمل غذائي لتقييم الحموضة المعوية ليسوسوميس في C. ايليجانس. هذا الأسلوب يسمح للكشف عن ليسوسوميس الكالينيزينج في الحيوانات الحية، ، ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات التجريبية بما في ذلك الدراسات المتعلقة بالشيخوخة، وأوتوفاجي، ونشوء حيوي الليزوزومية.
Introduction
ظهور المجاميع البروتين مقبول على نطاق واسع أن تكون السمة مميزة للشيخوخة في الخلايا حقيقية النواة1،2،3، وتشكيل التي يعتقد أن من بين السائقين مبدأ الشيخوخة الخلوية4 , 5 , 6 , 7-وهناك أدلة متزايدة على أن الخلايا العمر، تقويض البروتين البصر، مما يؤدي إلى زيادة في تجميع البروتين. انهيار بروتيوليسيس في شيخوخة الخلايا ينطوي على ضعف أوتوفاجي8 ، فضلا عن تدهور البروتين بوساطة بروتوزوم9. أخيرا، يتم زيادة أكسدة البروتين الذي لا رجعة فيه في الخلايا القديمة، وإضعاف زيادة تقويض البروتينات10.
أوتوفاجي كان يعتقد في البداية أن يكون عملية غير انتقائية لتدهور الجزء الأكبر من البروتينات التالفة، ولكن الدراسات الأخيرة أشارت إلى أن أوتوفاجي انتقائي للغاية لتقويض المجاميع البروتين واختلال العضيات التي لا قابلة للتحلل عن طريق آليات إزالة البروتين الأخرى11. أثناء عملية أوتوفاجي، هي المحتبس البروتينات التالفة ومجمعة في حويصلة غشاء مزدوج يسمى في أوتوفاجوسومي. ثم الصمامات هذه أوتوفاجوسومي مع العضيات الحمضية التي تسمى lysosomes، الأمر الذي يؤدي إلى تدهور من البضائع أوتوفاجوسومي12. تمثل نقطة النهاية لمسار أوتوفاجيك lysosomes والمشاركة في العمليات الخلوية المختلفة مثل التحكم النسخي وإصلاح الغشاء والاستشعار المغذيات؛ تسليط الضوء على دورها المركزي في التوازن الخلوية (إعادة النظر في الرقم 13). وأظهرت العديد من الدراسات وجود ارتباط بين انخفاض تعتمد على العمر وظيفة الليزوزومية و اضطرابات الأعصاب المختلفة13. دأبت، استعادة وظيفة الليزوزومية في خلايا كبار السن يمكن أن تؤخر ظهور المتصلة بالشيخوخة تعمل14،15. وتوحي الدراسات التكوين للوسط إينترالومين أن انهيار الدالة الليزوزومية في خلايا كبار السن ليس سبب انخفاضا في إنتاج البروتياز الليزوزومية16. وبدلاً من ذلك، اقترح أن فقدان إينتراليسوسومال الحموضة، مطلبا جوهريا لنشاطها الأنزيمي، قد تكمن وراء انخفاض يحلول بوساطة بروتيوليسيس17. لتكون قادرة على استكشاف هذه الفرضية، من الضروري تطوير الكواشف وبروتوكولات للتحقيق التغيرات الدينامية في تعويض درجة الحموضة في الخلايا الحية بطريقة متسقة وقابلة للتكرار.
الأمعاء من C. ايليجانس الأنسجة الأيضية الرئيسية في الديدان ومنظم حاسمة للتوازن المنهجي وعمر. لقد قمنا بتطوير فحوصات لتقييم التغييرات في حموضة التجويف lysosomes المعوية الديدان لتحديد كيف بوساطة يحلول proteolysis يسهم في الشيخوخة. على الرغم من أن فلوروفوريس حساسة لدرجة الحموضة قد استخدمت سابقا في C. ايليجانس بمناسبة ليسوسوميس المعوية، لم يكن هناك بعد محاولة لوضع بروتوكول ناجحة التي يمكن الكشف عن زيادات صغيرة في الأس الهيدروجيني الليزوزومية في فيفو18. هنا، نحن نقدم بروتوكول التي يمكن استخدامها للكشف عن فقدان الليزوزومية الحموضة في الخلايا المعوية من C. ايليجانس استخدام بروتوكول تغذية بسيطة ومريحة الذي يشتمل فلوروفوري حساسة لدرجة الحموضة (كدكفدا) في الغذاء OP50.
Protocol
Representative Results
Discussion
مجموعة متنوعة من الأحداث الجزيئية والخلوية تسهم في الشيخوخة، متأثر بسمات تاريخ الحياة والعوامل الوراثية. لدينا الدراسة الأخيرة22 تشير إلى أن دورة الإنجابية دوراً هاما في السيطرة على اللياقة البدنية سوما من خلال تنظيم ديناميات الليزوزومية الأس الهيدروجيني. أظهرنا أن يتعزز ه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس السلالات، والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة)، والمؤسسة الكندية للابتكار (CFI) للتمويل. ونود أن نشكر الدكتور تشين ليزين (إدارة أنظمة الخلية والتشريح، UT الصحة سان أنطونيو) للسماح بالاستخدام غير المقيد لها مرافق مختبر لجميع التجارب التي C. ايليجانس ، فضلا عن الدكتور وانغ اكسينج (المدير المعاون، مرفق التصوير الضوئي ، UT الصحة سان أنطونيو) للحصول على المساعدة مع الفحص المجهري [كنفوكل]. ونود أيضا أن نشكر الدكتور مايرون إغناطيوس لتقديم الدعم والتشجيع لتسهيل تصوير فيديو.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson’s disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?. Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington’s disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age?. Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
