Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação
Summary
Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.
Abstract
A resposta de danos de DNA (DDR) usa uma infinidade de proteínas para detectar, sinalizar e reparar lesões do ADN. Delinear essa resposta é fundamental para entender os mecanismos de manutenção do genoma. Desde o recrutamento e a troca de proteínas em lesões são altamente dinâmicos, seu estudo requer a capacidade de gerar danos ao DNA de uma forma rápida e espacialmente delimitado. Aqui, descrevemos procedimentos para induzir localmente o dano de DNA em células humanas, usando comumente disponível-varredura a laser confocal microscópio equipado com uma linha de laser 405 nm. Acumulação de manutenção do genoma fatores em listras do laser podem ser avaliadas por imunofluorescência (IF) ou em tempo real usando proteínas com repórteres fluorescentes. Usando fosforilada histona H2A. X (γ-H2A.X) e replicação proteína A (RPA) como marcadores, o método fornece resolução suficiente para discriminar os fatores recrutados localmente daqueles que se espalham na cromatina adjacente. Nós fornecemos mais scripts baseados em ImageJ para monitorar eficientemente a cinética de relocalization de proteína no DNA danificar sites. Estes refinamentos simplificam muito o estudo da dinâmica da DDR.
Introduction
As células estão constantemente expostas a fontes endógenas e exógenas de dano do ADN que ameaçam sua integridade genômica. O DDR é um conjunto de caminhos que detectam, sinalizar e reparar lesões do ADN para sustentar a estabilidade do genoma de sinalização. Em quebras de dupla-hélice do DNA (DSBs), a DDR ocorre principalmente em duas plataformas complementares: cromatina γ-H2A.X-rotulado e uma região de DNA (ssDNA) single-stranded ressecada normalmente revestidos com a vinculação ssDNA complexo RPA1,2.
UV-laser microirradiação de células pré-sensibilizadas com a timidina análogo 5-bromo-2′ desoxiuridina (BrdU) ou a tintura de DNA bisbenzimide Etóxido trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) cria uma mistura de lesões do ADN incluindo (single-stranded quebras SSBs) e DSBs que eliciam uma DDR localizada sobre a cromatina e o ssDNA plataformas3,4. Trabalhos anteriores mostraram que pode ser discriminado recrutamento dos fatores de manutenção do genoma para essas duas plataformas distintas no DSB usando laser de UV-A de alta energia (335-365 nm) combinado com IF2,5. Microscópios equipados com tais lasers são caros como eles exigem um laser de alta energia e dedicados UV-A transmissão objetivos tornando-os muito menos prevalente em contextos acadêmicos e farmacêuticos que microscópios confocal de varredura a laser com laser de 405 nm linhas. O estudo de recrutamento de proteína e troca em locais irradiados micro também é impedido pela análise de imagem manual laborioso necessária para descrever o comportamento dinâmico dos fatores de manutenção do genoma.
Aqui, nós mostramos que o pre-sensibilização das células com mancha de ácido nucleico BrdU ou BBET seguido usando microirradiação laser 405 nm em um microscópio confocal comum permite o monitoramento da dinâmica de fator de manutenção do genoma em lesões do ADN. Usar o γ-H2A.X ou subunidades complexas RPA como marcadores de plataforma juntamente com z-empilhamento para maior profundidade de campo e deconvolução para melhor resolução permite discriminar os fatores que são recrutados localmente para DSBs daqueles que se espalhou para o experimentador domínios de cromatina grande ao redor da lesão inicial. Esta sub classificação de acordo com distintos compartimentos intra nucleares ajuda a refinar as funções potenciais de proteínas descaracterizadas recrutadas para sites micro irradiados. Além disso, fornecemos protocolos convenientes e otimizado de gasodutos para analisar rapidamente a dinâmica dos fatores de manutenção do genoma usando o software open-source Fiji (uma distribuição ImageJ)6,7,8. Estes refinamentos para métodos atuais de microirradiação processam o estudo da DDR possível em praticamente qualquer configuração de laboratório.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando os métodos descritos acima, 405 nm laser microirradiação de células pré-sensibilizadas com BBET ou BrdU permite a geração localizada de lesões do ADN incluindo DSBs dentro dos núcleos de células humanas de aderentes. Cinética de DDR para estes DSBs são semelhantes aos gerados com outros métodos em células eucarióticas9,18,19. Ressecção de ORL em locais irradiados micro leva a ssDNA-geração, que pode ser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá [Discovery grant 5026 da manhã] e por uma geração de cientistas bolsa da sociedade de pesquisa de câncer [21531 para Marlene]. Agradecemos a Jean-François Lucier para fornecer excelente controle de qualidade dos scripts Python Fiji e conselhos na análise estatística. Agradecemos a receita de solução de fixação se Dr. Stephanie A. Yazinski. Agradecemos a Paul-Ludovic Karsenti para ajuda com medições de potência do laser.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -. C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
