Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

Les cellules sont constamment exposés à des sources de dommages à l’ADN endogènes et exogènes qui menacent leur intégrité génomique. Le DDR est un ensemble de voies que détecter et réparer les lésions de l’ADN pour maintenir la stabilité du génome de signaux de signalisation. Cassures double-brin d’ADN (CDB), le DDR se produit principalement sur les deux plateformes complémentaires : γ-H2A.X-étiqueté de la chromatine et une région d’ADN (ADN simple brin) simple brin réséquée généralement recouvertes d’ADNsb-liaison complexe Apr^1,2.

UV-laser micro-irradiation des cellules pré sensibilisées avec la thymidine analogique 5-bromo-2′ désoxyuridine (BrdU) ou la teinture d’ADN bisbenzimide éthylate TRIHYDROCHLORURE (BBET, Hoechst 33342) crée un mélange de lésions de l’ADN y compris cassures simple brin ( BSN) et CDB qui suscitent un DDR localisé sur la chromatine et ADN simple brin plates-formes^3,4. Des travaux antérieurs ont montré que recrutement des facteurs d’entretien de génome de ces deux plateformes distinctes à ORD peut être distinguée en utilisant des lasers de haute énergie UV-A (335-365 nm) combinés avec IF^2,5. Microscopes équipés de ces lasers sont coûteuses car elles nécessitent un laser à haute énergie et dédiés objectifs transmission UV-A, ce qui les rend beaucoup moins répandue dans les milieux universitaires et pharmaceutiques que les microscopes confocaux à balayage laser avec laser à 405 nm lignes. L’étude du recrutement de protéines et d’échange sur les sites de micro-irradiés s’oppose également à l’analyse d’image manuel laborieux pour décrire le comportement dynamique des facteurs d’entretien de génome.

Ici, nous montrons que la sensibilisation préalable des cellules avec des taches d’acide nucléique BrdU ou BBET suivie par micro-irradiation utilisant un laser à 405 nm sur un microscope confocal commun permet de contrôler la dynamique de facteur de maintenance du génome aux lésions de l’ADN. À l’aide de γ-H2A.X ou sous-unités complexes de l’armée patriotique rwandaise comme marqueurs de la plate-forme avec empilement z pour une plus grande profondeur de champ et déconvolution pour une résolution améliorée permet l’expérimentateur de discriminer les facteurs qui sont recrutés localement à la CDB de celles qui se propagent à domaines de chromatine grand entourant la lésion initiale. Cette sous-classification selon différents compartiments intra nucléaires contribue à affiner les rôles possibles des protéines non caractérisés recrutés aux sites de micro-irradié. En outre, nous fournissons des protocoles pratiques et optimisée des pipelines pour rapidement analyser la dynamique des facteurs d’entretien de génome en utilisant le logiciel open-source Fidji (une distribution de ImageJ)^6,7,8. Ces raffinements aux méthodes actuelles de micro-irradiation de l’étude du processus de DDR rendent possible dans pratiquement n’importe quel arrangement de laboratoire.