Целом гора Confocal микроскопии для уха взрослого кожи: модель системы для изучения нейро сосудистые ветвления морфогенеза и иммунных клеток распределения
Summary
Здесь мы описываем высокого разрешения всего гора изображений метод в коже уха всей взрослой мыши, что позволяет нам визуализировать ветвления морфогенеза и кучность периферических нервов и кровеносных сосудов, а также распределение иммунных клеток.
Abstract
Здесь мы представляем протокол кожи уха взрослого целом гора изображений техника для изучения всеобъемлющей трехмерной нейро сосудистые ветвления морфогенеза и структурирования, а также распределение иммунных клеток на клеточном уровне. Анализ периферических нервов и кровеносных сосудов анатомических структур во взрослых тканях предоставляет некоторые идеи в понимание функциональных нейро сосудистые проводки и нейро сосудистые дегенерации в патологических условиях заживление ран. Как весьма информативный модель системы мы сосредоточили наши исследования на кожу уха взрослого, который легко доступны для рассечения. Наш простой и воспроизводимые протокол обеспечивает точное описание клетчатых компонентов на всей коже, например периферических нервов (сенсорные аксонов, симпатичная(ый) аксонов и Шванновские клетки), кровеносные сосуды (эндотелиальные клетки и клетки сосудистой гладкой мышцы ) и воспалительных клеток. Мы считаем, что этот протокол будет проложить путь к расследованию морфологические аномалии в периферических нервов и кровеносных сосудов, а также воспаление в коже уха взрослого при различных патологических условиях.
Introduction
Кожа состоит из трех слоев: эпидермиса, дермы и гиподермы. Он использовался как модель системы для изучения стволовых клеток обслуживания, дифференциация и морфогенез в развитие, а также регенерации, tumorigenesis и воспаления в взрослых. Кожа является Богато васкуляризированной и иннервируются таким образом, что хорошо скоординированного развития периферической нервной системы и сосудистой системы.
Ранее мы продемонстрировали изображений техника целом гора эмбриональных кожи с несколькими маркировки для изучения нетронутыми периферических нервов и кровеносных сосудов, включая их клеточных компонентов1,2,3, 4: сенсорные аксоны, симпатичная(ый) аксоны, Шванновские клетки в нервы, эндотелиальные клетки, pericytes и сосудистой гладких мышечных клеток (VSMCs) в кровеносных сосудах. Во время ангиогенеза первичной капиллярной сети проходит интенсивный сосудистого ремоделирования и превращается в иерархической сосудистой разветвленную сеть. В развивающихся дермы/гиподермы артерий филиал наряду с периферической сенсорные нервы и Вены, а затем образуют прилегающих к артерии. После того, как иерархическое сосудистой сети тщательно покрыта VSMCs, симпатические нервы протянулись вдоль и иннервируют большого диаметра сосудов1,5,6. Несмотря на значимость в тесную связь между развивающихся нервной и сосудистой систем главный вопрос был решать, что произойдет с нейро сосудистые сетей в различных патологических ситуаций в взрослых. Трехмерных изображений высокого разрешения необходимо оценить патогенеза, наряду с анатомически узнаваемые ветвления морфогенеза и кучность.
Нейронов и сосудистой морфогенеза в кожи взрослых мыши обычно анализируемой окрашивание ткани секции. Другие исследования использовали всего гора изображения кожи для визуализации периферических нервов и кровеносных сосудов, в дополнение к волосяных фолликулов, сальных желез и мышца пили мышцы7,8,9. Однако толщина кожи взрослых затрудняет анализ кожи на всю глубину.
В настоящем исследовании мы разработали роман с высоким разрешением изображений целом гора уха взрослого кожи для преодоления этих проблем. Ухо кожа легко доступны для диссекции и последующей целом гора изображения кожи над ее всю глубину. Таким образом это простой и очень воспроизводимый метод, который может применяться для сравнения трехмерную архитектуру периферической нервной и сосудистой систем в коже, с всеобъемлющей количественной измерения. Мы продемонстрировали, что выравнивание периферической сенсорной и симпатических нервов с большого диаметра сосудов сохраняется в взрослых кожи. Цель настоящего Протокола заключается в визуализации ветвления морфогенеза и кучность периферических нервов и кровеносных сосудов, а также распределение иммунных клеток на клеточном уровне в модели взрослых мыши в различных условиях, таких как воспаление и Регенерация.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает immunonohistochemical целом гора изображений уха взрослого кожи для анализа нервно сосудистых структур и распределение иммунных клеток. Мы считаем, что этот метод имеет многочисленные экспериментальные преимущества для исследователей для изучения ветвления морфогенез…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим K. Gill Лаборатория управления и технической поддержки, J. Hawkins и сотрудников национальных институтов здравоохранения (НИЗ) 50 животных фонда для помощи с мыши уход и р. Рид и F. Baldrey для административной помощи. Спасибо также S. Motegi и м. Udey для обмена их уха кожи рассечение протокол, N. ожоги редакционной помощи, и члены лаборатории стволовых клеток и нейро-сосудистая биология для технической помощи и вдумчивого обсуждения. Т. Ямадзаки был поддержан японского общества для поощрения науки (JSP) низ-KAITOKU. Эта работа была поддержана интрамуральных исследовательской программы национального сердца, легких и крови института (HL005702-11-ю.м.)
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
- Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
- Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
- Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
- Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
- Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
- Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
- Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
- O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
- Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
