Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni
Summary
Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell’orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.
Abstract
Qui, presentiamo un protocollo di una pelle dell’orecchio dell’adulto intero-monta imaging tecnica per studiare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare tridimensionale completa e patterning, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare. L’analisi della periferiche strutture anatomiche del nervo e dei vasi sanguigni nei tessuti adulti fornisce alcuni spunti per la comprensione della funzionale neuro-vascolare cablaggio e degenerazione neuro-vascolare in condizioni patologiche come la guarigione della ferita. Come sistema modello altamente informativo, abbiamo concentrato i nostri studi sulla pelle dell’orecchio dell’adulto, che è facilmente accessibile per la dissezione. Il nostro protocollo semplice e riproducibile fornisce una rappresentazione accurata dei componenti cellulari della pelle intera, come i nervi periferici (assoni sensoriali, simpatici assoni e le cellule di Schwann), vasi sanguigni (cellule endoteliali e cellule muscolari lisce vascolari ) e cellule infiammatorie. Crediamo che questo protocollo spianerà la strada per studiare le anomalie morfologiche in nervi periferici e dei vasi sanguigni così come l’infiammazione della pelle dell’orecchio dell’adulto sotto diverse condizioni patologiche.
Introduction
Pelle è composto da tre strati: l’epidermide, derma e ipoderma. È stato utilizzato come sistema modello per studiare il mantenimento delle cellule staminali, la differenziazione e la morfogenesi in sviluppo come pure la rigenerazione, tumorigenesi e infiammazione in adulto. Pelle è riccamente vascolarizzata ed innervata tale che lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sistema vascolare è ben coordinato.
Precedentemente abbiamo dimostrato una tecnica di imaging intero-monta embrionale della pelle con l’etichettatura più per studiare i nervi periferici intatti e vasi sanguigni, compresi i loro componenti cellulari1,2,3, 4: assoni sensoriali, simpatici assoni, cellule in nervi Schwann, cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) nei vasi sanguigni. Durante il processo di angiogenesi, una rete capillare primaria subisce intensivo rimodellamento vascolare e si sviluppa in una rete gerarchica di ramificazione vascolare. In sviluppo derma/ipoderma, arterie ramificano al fianco di vene e nervi sensoriali periferici quindi formano adiacenti alle arterie. Dopo la rete vascolare gerarchica è completamente ricoperta di VSMCs, nervi simpatici si estendono lungo e innervano i vasi sanguigni di grande diametro1,5,6. Nonostante il significato in stretta associazione tra i sistemi nervosi e vascolari in via di sviluppo, è stata una questione importante per affrontare ciò che accade alle reti neuro-vascolare in varie situazioni patologiche negli adulti. La formazione immagine tridimensionale ad alta risoluzione è necessaria apprezzare la patogenesi, insieme a morfogenesi di ramificazione anatomicamente riconoscibile e patterning.
Morfogenesi neuronale e vascolare nella pelle del topo adulto è comunemente analizzata macchiando tessuto sezione. Altri studi hanno utilizzato intero-monta la formazione immagine della pelle per visualizzare i nervi periferici e vasi sanguigni, oltre ai follicoli piliferi, ghiandole sebacee e arrector pili muscoli7,8,9. Tuttavia, lo spessore della pelle adulta ha reso difficile analizzare la pelle nel corso di tutta la sua profondità.
Nello studio presente, abbiamo sviluppato un romanzo imaging ad alta risoluzione di intero-monta della pelle dell’orecchio dell’adulto per vincere queste sfide. Pelle dell’orecchio è facilmente accessibile per la dissezione e la formazione immagine intero-monta successiva della pelle nel corso di tutta la sua profondità. Così, è un metodo semplice e altamente riproducibile che possa essere applicato per confrontare l’architettura tridimensionale dei sistemi nervosi e vascolari periferici nella pelle, con misurazioni di quantificazione completa. Abbiamo dimostrato che l’allineamento dei nervi periferici sensoriali e simpatici con i vasi sanguigni di grande diametro è conservato nella pelle adulta. L’obiettivo del presente protocollo è quello di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare in modelli di topo adulto in varie condizioni quali l’infiammazione e rigenerazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive l’intero-monta immunonohistochemical imaging della pelle dell’orecchio dell’adulto per l’analisi delle strutture neuro-vascolari e la distribuzione delle cellule immuni. Crediamo che questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per i ricercatori a studiare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di vasi sanguigni e nervi periferici, così come la distribuzione tridimensionale di componenti della pelle tra cui capelli e cellule del sistema immunitario follicoli. I risultati dell’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo K. Gill per la gestione del laboratorio e supporto tecnico, J. Hawkins e il personale del National Institutes of Health (NIH) costruzione impianto 50 animali per l’assistenza con cura del mouse e R. Reed e F. Boi per l’assistenza amministrativa. Grazie anche a Motegi S. e M. Udey per loro orecchio pelle dissezione protocollo N. Burns per aiuto editoriale e membri del laboratorio di cellule staminali e biologia Neuro-vascolare per aiuto tecnico e riflessivo discussione di condivisione. T. Yamazaki è stata sostenuta dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) NIH-KAITOKU. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del cuore nazionale, polmone e sangue Institute (HL005702-11 al Y.M.)
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
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