Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie
Summary
Hier beschrijven we een hoge resolutie geheel-mount beeldvorming methode in de hele volwassen muis oor huid, waarmee we kunnen visualiseren vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuun cel distributie.
Abstract
Hier presenteren we een protocol van de huid van een geheel-mount volwassen oor imaging techniek om te bestuderen van de uitgebreide driedimensionale neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en patronen, evenals immuun cel distributie op een cellulair niveau. De analyse van perifere zenuwen en bloedvat anatomische structuren in volwassen weefsels biedt sommige inzicht in het begrip van functionele neuro-vasculaire bedrading en neuro-vasculaire degeneratie in pathologische omstandigheden zoals de wondgenezing. Als een zeer informatief modelsysteem, hebben we onze studies gericht op volwassen oor huid, dat gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie is. Onze eenvoudige en reproduceerbare protocol biedt een nauwkeurige voorstelling van de cellulaire componenten in de gehele huid, zoals de perifere zenuwen (sensorische axonen, sympathieke axonen en cellen van Schwann), bloedvaten (endotheliale cellen en vasculaire zachte spiercellen ), en ontstekingscellen. Wij geloven dat dit protocol zal de weg effenen naar onderzoeken morfologische afwijkingen in het perifere zenuwen en bloedvaten en de ontsteking in de huid van de volwassen oor onder verschillende pathologische condities.
Introduction
Huid bestaat uit drie lagen: de epidermis, de dermis en de hypodermis. Het is gebruikt als een modelsysteem om te studeren stamcel onderhoud, differentiatie en voedselproductie in ontwikkeling evenals de regeneratie, tumorvorming en ontstekingen bij volwassenen. Huid is rijkelijk gevacuoliseerd en geïnnerveerd zodanig zijn dat de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel en vasculaire systeem goed gecoördineerd.
Wij hebben eerder aangetoond een geheel-mount embryonale huid beeldvormende techniek met meerdere labelen om te studeren intact perifere zenuwen en bloedvaten, met inbegrip van hun cellulaire componenten1,2,3, 4: sensorische axonen, sympathieke axonen Schwann cellen in zenuwen, endotheliale cellen, pericytes en vasculaire zachte spiercellen (VSMCs) in de bloedvaten. Tijdens de angiogenese, een primaire capillaire netwerk ondergaat intensieve vasculaire remodeling en ontwikkelt zich tot een hiërarchisch vasculaire vertakkende netwerk. In de ontwikkelingslanden dermis/hypodermis, slagaders vertakken naast perifere sensoriële zenuwen en aders dan vormen grenzend aan de slagaders. Nadat het hiërarchische vasculaire netwerk grondig met VSMCs bedekt is, sympathische zenuwen uitbreiden langs en innervate grote diameter bloedvaten1,5,6. Ondanks het belang in de nauwe samenwerking tussen de ontwikkelingslanden nerveus en vasculaire systemen, een grote vraag geweest om te pakken wat gebeurt er met de neuro-vasculaire netwerken in diverse pathologische situaties bij volwassenen. Een driedimensionale high-resolution imaging is noodzakelijk om te waarderen de pathogenese, samen met anatomisch herkenbaar vertakkende genuitdrukking en patronen.
Neuronale en vasculaire morfogenese in volwassen muis huid is vaak geanalyseerd door weefsel sectie kleuring. Andere studies hebben geheel-mount beeldvorming van de huid gebruikt voor het visualiseren van de perifere zenuwen en bloedvaten, naast de haarzakjes sebaceous klieren en de arrector pili spieren7,8,9. Echter, de dikte van volwassen huid heeft het moeilijk gemaakt voor het analyseren van de huid over de gehele diepte.
In de huidige studie ontwikkelden we een nieuwe hoge resolutie geheel-mount beeldvorming van volwassen oor huid om deze uitdagingen te overwinnen. Oor huid is gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie en latere geheel-mount beeldvorming van de huid over de gehele diepte. Dus, het is een eenvoudig en zeer reproduceerbare methode die kan worden toegepast om te vergelijken van driedimensionale architectuur van perifere zenuw- en vasculaire systemen in de huid, met uitgebreide kwantificering metingen. We toonden aan dat de uitlijning van perifere zintuiglijke en sympathische zenuwen met grote diameter bloedvaten bewaard in de volwassen huid gebleven is. Het doel van dit protocol is te visualiseren vertakkende genuitdrukking en de patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals de immuun cel distributie op een cellulair niveau in volwassen Muismodellen in verschillende omstandigheden zoals ontsteking en regeneratie weer gecontroleerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de geheel-mount immunonohistochemical beeldvorming van volwassen oor huid voor de analyse van de neuro-vasculaire structuren en immuun cel distributie. Wij geloven dat deze methode heeft tal van voordelen voor onderzoekers te bestuderen vertakkende genuitdrukking en de patronen van de perifere zenuwen en bloedvaten, alsmede driedimensionale distributie huid componenten zoals immuuncellen en haar experimentele follikels. De resultaten van de beeldvorming kunnen worden gekwantificeerd aan de hand va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken K. Gill voor het Laboratoriumbeheer en technische ondersteuning, J. Hawkins en het personeel van National Institutes of Health (NIH) gebouw 50 dier faciliteit voor de hulp bij de zorg van de muis, en R. Reed en F. Baldrey voor administratieve bijstand. Ook dank aan S. Motegi en M. Udey voor het delen van hun oor huid dissectie protocol, N. Burns voor redactionele hulp, en de leden van het laboratorium van de cel van de stam en Neuro-vasculaire biologie voor technische hulp en nadenkende bespreking. T. Yamazaki werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) NIH-KAITOKU. Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van de National Heart, Lung en bloed Instituut (HL005702-11 tot en met Y.M.)
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
- Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
- Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
- Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
- Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
- Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
- Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
- Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
- O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
- Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
