Aislamiento de células endoteliales humanas de Colon Normal y el Carcinoma colorrectal - un protocolo mejorado

El proceso de aislamiento ha sido aprobado por el Comité de ética local de la Universidad de Erlangen de centro médico (#159_15 B, estudio de TuMiC). Criterios de inclusión de pacientes fueron los siguientes: CRC, UICC etapa I-IV, sin antecedentes de enfermedad inflamatoria intestinal y ningún tratamiento neoadyuvante. 1. cirugía y preparación del tejido para aislamiento de células individuales Obtener muestras por cirugía de un paciente CRC (tejido de carcinoma > 0.5 g, tumor no necrótico central; tejido normal de colon > 10 cm de distancia del sitio del tumor). Las piezas de tejido obtenidos son en su mayoría 1 g para el colon normal. Si piezas > 1 g se obtienen, dividido en múltiples pedazos de 1 g con un bisturí fresco para la transformación posterior del tejido.Nota: Si el pedazo de tejido del tumor es inferior a 0,5 g desde el comienzo, el aislamiento generalmente falla. Recoger fresco desmontado piezas de tejido con pinzas estériles en 40 mL de hielo frío Hanks equilibrada solución de sal (HBSS) suplementado con penicilina/estreptomicina/amphothericin B (1% HBSS-pluma/strep/ampho) en tubos de centrífuga de 50 mL transferirlos rápidamente a la laboratorio.Nota: Tejido de Colon es con frecuencia altamente contaminado con bacterias/hongos desde el inicio. Durante todo el procedimiento de aislamiento, estreptococos/pluma/ampho debe añadirse a todas las soluciones para eliminar organismos contaminantes. Lave cada pieza de tejido por lo menos 4 veces con hielo 40 mL frío HBSS-pluma/strep/ampho (ver paso 1.3) en tubos de centrífuga de 50 mL mediante la transferencia de las piezas de tejido secuencialmente del tubo de centrífuga de uno al siguiente tubo con unas pinzas estériles. Pinzas limpias después de cada paso con etanol al 70%. Utilice pinzas separadas para el carcinoma y piezas de tejido de colon normal. Pesar de todas las piezas de tejido.Nota: No coloque piezas de tejido directamente en una báscula para pesar. Después de lavar, pesar el último tubo de centrífuga que contiene el tejido antes y después de introducir las piezas de tejido. Calcular el peso de piezas de tejido individual por sustracción. 2. generación de suspensión unicelular Nota: Se recomienda mantener el tejido hidratado en todo momento. Si existe, quitar grasa adjunta, otros tejidos no tumorales o piezas de tejido potencialmente necrótico del espécimen de cirugía mediante la transferencia de las piezas de tejido en una célula estéril cultura de Petri utilizando pinzas estériles. Mantenga las piezas de tejido hidratadas en todo momento mediante la adición de 3-5 mL de HBSS-pluma/strep/ampho. Recortar las piezas de tejido con un bisturí estéril fresco (figura 1). Consultar a un patólogo en caso de identificación de tejido claro. Pique el tejido restante en trozos pequeños (aproximadamente 2 × 2 × 2 m m3) con un bisturí fresco con una hoja curva. Transferencia de piezas de tejido con pinzas estériles en tubos de la disociación del tejido (por ejemplo, tubos de gentleMACS C) precargadas con precalentado (37 ° C) medio de cultivo celular (Dulbecco´s modificado medio basal de eagle mediana de [DMEM]) según el fabricante instrucciones.Nota: Intente usar el bisturí como una herramienta de balanceo. No exprima las células con el fin de evitar daño tisular. Piezas de tejido Digest/disociar usando un Disociador de tejido (como gentleMACS Octo disociador) en combinación con el kit de la disociación de tumor de tejido humano usando las instrucciones del programa “37C_h_TDK_1” después de la manufacturer´s. Centrifugar tubos de disociación durante 1 min a 300 x g a temperatura ambiente (RT). Añadir 10 mL de precalentado (37 ° C) DMEM suplementado con 0.5% suero bovino fetal (FBS) (DMEM-bajo) en cada tubo utilizando una pipeta serológica y la suspensión de células usando un colador celular (tamaño de poro de 100 μm) en la parte superior un tubo de centrífuga de 50 mL pipetear la célula del filtro suspensión sobre el filtro. Añadir 10 mL de DMEM-baja otra vez a cada tubo de Mac por una pipeta serológica y transferir células restantes a la coladera de la célula en la parte superior del tubo de centrífuga de 50 mL. Lave el filtro de la celda una vez con un adicional 10 mL de medio DMEM-baja con una pipeta serológica. Centrifugar la suspensión celular por 7 min a 300 x g a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Resuspender las células en 5 mL de medio basal endotelial precalentado (EBM) -2-microvascular (MV) suplementado (Lonza) con estreptococos/pluma/ampho en el mismo tubo de centrífuga de 50 mL. Suspensión de células de la placa en un matraz de cultivo celular T-25 previamente recubierto de un día para otro 1,5% gelatina-tamponada de fosfato salino (PBS) a 37 ° C con 5% CO2. Incubar las células durante 24 h a 37 ° C y 5% CO2, lavan las células dos veces con aproximadamente 5 mL de PBS y añadir 5 mL de medio fresco. Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO2 hasta 80-90% de confluencia (generalmente 5-7 días) con intervalos de 48 h de renovación medio. 3. de FACS-clasificación de las células endoteliales Nota: Tratar de evitar la pérdida de células en cualquier momento, por ejemplo, al limitar el procedimiento de tinción para la incubación de las células en un tubo único. Separar las células con 1 mL de accutase (aproximadamente 10 min) y añadir 4 mL de medio de EBM-2-MV precalentado (37 ° C). Determinar el recuento celular con una célula automatizada contando dispositivo (rango 10-25 μm). Centrifugue la suspensión de células de 4 min con 250 g de x en RT y descartar el sobrenadante. Resuspender las células en tampón FACS precalentado (PBS 1 x, 2.5% albúmina de suero bovino [BSA], pH de EDTA 5 mM 8.0, 10 μm Y-27632) según el conteo de células (5 x 106/ml). Añadir anticuerpos FACS de tinción según volumen de recuento/FACS-buffer celular: CD31-FITC (100 μl/mL = 1/10), CD144 vascular endotelial (VE) – cadherin – PE (100 μl/mL = 1/10), CD105-APC (25 μl/mL = 1/40), mezcle e incube durante 7 min a TA protegido de la luz; suavemente flick e incubar durante otros 8 minutos (para un tiempo total de incubación de 15 minutos). Añadir 2 mL de tampón FACS a la suspensión de células marcadas con una pipeta serológica. Centrifugar durante 4 min con 250 g de x en RT y descartar el sobrenadante. Lavar dos veces añadiendo 2 mL de tampón de FACS y realizar una posterior centrifugación durante 4 min a 250 g de x en RT y deseche el sobrenadante. Resuspender las células en 500 μl de precalentado EBM-2-MV-pluma/strep/ampho y células de transferencia en el instrumento de ordenación de FACS. Las células endoteliales se mueren rápidamente durante el proceso de clasificación si se enfría el FACS-instrumento. Por lo tanto, llevar a cabo la clasificación de las células endoteliales en RT e inmediatamente la transferencia de células colectadas a la incubadora de 37 ° C, luego.Nota: El instrumento de FACS es generalmente sin esterilizar. Recopilar tipo triple-positive células directamente en una placa de cultivo celular (p. ej., placa de 24 pocillos previamente recubierta de un día para otro 1,5% gelatina-PBS) llenan con 0,5 mL de medio fresco precalentado (EBM-2-MV-pluma/strep/ampho).Nota: Revise la suspensión de células después de clasificar utilizando un microscopio. Si las células se agrupan, tratar de obtener una distribución uniforme de la célula en la placa de cultivo celular mezclándolos lentamente o añadiendo medio. Cultivar células hasta confluencia de 90-100% con intervalos de 48 h de renovación medio y expandir las células en el tamaño de plato de cultura deseado (placa de 24 pozos → 12 → placa de la pozo 3,5 cm plato → T-25 → T-75). 4. la cosecha y caracterización de células endoteliales puras Las células en la confluencia de 90-100% de la cosecha y caracterizarlos mediante un método adecuado (por ej., FACS, citoquímica, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o células endoteliales función ensayos7,8). Analizar las células aisladas con cualquier método de caracterización es elegido.