通常のコロンと大腸癌 - 改良されたプロトコルから人間の血管内皮細胞の分離

分離プロセスは大学医療センター エアランゲン (#159_15 B、TuMiC 研究) 倫理委員会によって承認されています。患者の選択基準は次のとおり: CRC、UICC のない術前治療、炎症性腸疾患の既往のない – IV 段階します。 1. 手術と組織の単一細胞の分離のための準備 CRC 患者から手術検体を採取 (癌組織 > 0.5 g、中央非壊死部; 正常な大腸組織 > 腫瘍部位から遠い 10 cm)。 得られた組織の部分が大抵 通常のコロン 1 g。もし作品 > さらにティッシュの処理の新鮮なメスを使用して複数の 1 g 個に分割され、1 g が得られます。注: 腫瘍組織部分が発症から 0.5 g 以下、分離通常失敗します。 収集新鮮に冷たいハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) ペニシリン/ストレプトマイシン/amphothericin B を添加した氷の 40 mL の滅菌鉗子を使用して組織の部分が固定されていない (1 %hbss-ペン/連鎖球菌/ampho) 50 mL 遠心チューブ内に迅速に転送して、実験室。注: 結腸組織は、細菌/真菌発症からの頻繁に非常に汚染されています。分離の全体の手順中にペン/連鎖球菌/ampho は、汚染微生物を排除するためにすべてのソリューションに追加する必要があります。 少なくとも 4 回 40 mL 氷で各組織の部分を洗浄冷たい HBSS-ペン/連鎖球菌/ampho (手順 1.3 参照) 50 mL 遠沈管滅菌鉗子を使用して次のチューブに 1 つ遠心分離機管から順次組織部分を移すようにで。 70% エタノールで各ステップ後きれいな鉗子。 癌と正常の大腸組織部分別鉗子を使用します。 すべての組織の部分の重量を量る。注: は、計量のスケールに直接組織部分を入れてはいけません。洗浄後、組織の部分に入る前に、と後に組織を含む最後の遠心管の重量を量る。減算して個々 の組織の部分の重量を計算します。 2. 単一細胞懸濁液の生成 注: すべての回でしっとり組織を維持することをお勧めします。 それが存在する場合は、滅菌鉗子を用いた無菌細胞培養シャーレの組織部分を転送することによって、手術標本から接続されている脂肪、その他の非腫瘍組織または潜在的壊死部分を削除します。 HBSS-ペン/連鎖球菌/ampho の 3-5 mL を追加してすべての回でしっとりティッシュの部分を保ちます。 新鮮な滅菌メス (図 1) を使用して組織の部分をトリミングします。組織識別が明確でない場合は、病理医を参照してください。 残りの組織を細かくミンチ (約 2 × 2 × 2 mm3) 湾曲した刃を持つ新鮮なメスを使用します。事前に予め温めておいた (37 ° C) 細胞培養液 (Dulbecco´s 改変イーグル培地 [DMEM] 基礎培地) 製造元によると満ちて組織解離チューブ (たとえば、gentleMACS C 管) に滅菌ピンセットでティッシュ部分を転送します。指示に従います。注: ロッキング ツールのようなメスを使用しようとします。組織の損傷を避けるために、細胞を押さないようにしてください。 ダイジェスト/分離プログラム”37C_h_TDK_1″、manufacturer´s、次の命令を使用して人間のティッシュの腫瘍解離キットとの組み合わせで (gentleMACS Octo 発生器) のような組織の発生器を使用して組織の作品。 常温 (RT) 300 × g で 1 分間解離チューブを遠心します。 予め温めておいた (37 ° C) で 0.5% ウシ胎児血清 (FBS) (DMEM-低) 血清ピペットを使用して各管に DMEM の 10 mL を追加し、セルをピペッティングにより 50 mL 遠心管の上にセル ストレーナー (100 μ m 孔サイズ) を使用して細胞懸濁液をフィルタ リングフィルターの上に懸濁液。 血清ピペットによって各 MAC 管に再度 DMEM 低の 10 mL を追加し、残りのセルを 50 mL 遠心管の上にセル ストレーナーに転送します。 追加の 10 mL の血清ピペットを使用して低 DMEM 培地で一度セル ストレーナーを洗浄します。 常温 300 x g で 7 分の細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。 予め温めておいた内皮細胞基本培地 (EBM)-2 の 5 mL の細胞を再懸濁します-微小血管 (MV) 培 (ロンザ) ペン/連鎖球菌/ampho 同じ 50 mL 遠心管中で。 1.5% ゼラチン リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5% CO2と 37 ° c で一晩プレコート T-25 細胞培養用フラスコでのプレート細胞懸濁液。 37 ° C、5% CO2で 24 時間のセルを孵化させなさい、慎重に約 5 mL の PBS、セル 2 回を洗浄し、新鮮な培地 5 mL を加えます。 中更新の 48 h 間隔で 80-90% の confluency (通常 5-7 日) まで 37 ° C および 5% の CO2の細胞を栽培してください。 3. 血管内皮細胞の FACS 並べ替え 注: は、例えば1 つの試薬で細胞の培養を汚損プロシージャを制限することによって、任意の時点で細胞を失うことを避けるために試み。 Accutase (約 10 分)、1 mL でセルを外し、予め温めておいた (37 ° C) EBM 2 MV の中の 4 つの mL を追加します。 デバイス (範囲 10-25 μ m) を数える自動細胞を使用して細胞数を決定します。 RT で 250 x g と 4 分のための細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。 予め温めておいた FACS バッファー内の細胞を再懸濁します (2.5% ウシ血清アルブミン [BSA] 5 mM EDTA pH 8.0、10 μ M 1 × PBS Y-27632) 細胞数 (5 x 106/mL) によると。 FACS 染色抗体細胞数/FACS バッファー量に応じて追加: CD31 FITC (100 μ L/mL = 1/10)、CD144/血管内皮 (VE) – カドヘリン – PE (100 μ L/mL = 1/10), CD105 APC (25 μ L/mL = 1/40)、ミックス、光から保護された RT で 7 分間インキュベート軽くフリックし、(15 分の合計のインキュベーション時間) の別の 8 分間インキュベートします。 血清ピペットを使用してラベルの付いたセル懸濁液 2 mL の FACS バッファーを追加します。 RT で 250 x g で 4 分間遠心し、上清を破棄します。 FACS バッファーの 2 mL を追加して 2 回を洗って RT で 250 x g で 4 分間その後遠心分離を行うし、上澄みを廃棄します。 予め温めておいた EBM-2-MV-ペン/連鎖球菌/ampho の 500 μ L のセルおよび FACS 並べ替え楽器に転送細胞を再懸濁します。 血管内皮細胞は、FACS 装置の冷却される場合すぐに並べ替えのプロセス中に死んでしまいます。したがって、RT で血管内皮細胞の選別を行い、集められたセルを 37 ° C の定温器の後にすぐに転送。注: FACS 装置は通常生殖不能! 細胞培養ディッシュ (例えば1.5% ゼラチン PBS で一晩プレコート 24 ウェル プレート) に直接並べ替え/収集トリプル陽性細胞は、予め温めておいた新鮮な媒体 (EBM-2-MV-ペン/連鎖球菌/ampho) の 0.5 mL でいっぱい。メモ: は、顕微鏡を使用して並べ替え後細胞懸濁液を確認します。セルを一緒にクラスター化場合、は、ゆっくりとそれらを混合または媒体の追加によって細胞培養皿でもセル分布を取得を試みます。 中更新の 48 h 間隔で 90-100% の confluency まで細胞を育成し、細胞を目的のカルチャ皿サイズに拡張 (24 ウェル プレート → 12 ウェル プレート → 3.5 cm 皿 → T-25 T-75)。 4. 収穫と純粋な内皮細胞のキャラクタリゼーション 90-100% の confluency に細胞を収穫し、(例えば、 FACS 細胞化学、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) や血管内皮細胞機能の試金7,8) 適切な方法でそれらを特徴付けます。 どちらの評価方法の選択と隔離されたセルを分析します。