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Cancer Research

Isolamento di cellule endoteliali umane da Colon normale e Carcinoma colorettale - un protocollo migliorato

Published: April 04, 2018
doi:
10.3791/57400
, , , , , , , , ,
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg

Summary

Cellule endoteliali tumorali sono fattori determinanti importanti del microambiente tumorale e il decorso della malattia. Qui, un protocollo per l’isolamento di cellule endoteliali pure e praticabile da carcinoma colorettale umano e colon normale a essere impiegata nella ricerca di droga test e la patogenesi è descritto.

Abstract

Cellule primarie isolate da carcinoma umani sono strumenti preziosi per identificare i meccanismi patogeni che contribuiscono alla progressione e lo sviluppo della malattia. In particolare, le cellule endoteliali (CE) che costituiscono la superficie interna dei vasi, direttamente partecipare alla consegna dell’ossigeno, apporto nutritivo e la rimozione dei rifiuti prodotti e dai tumori e sono quindi principalmente coinvolte nella costituzione del tumore microambiente (TME). Cellule endoteliali tumorali (TECs) possono essere utilizzate come biosensori cellulari del microambiente intratumoral istituito dalla comunicazione fra il tumore e cellule stromali. TECs servono anche come gli obiettivi della terapia. Di conseguenza, nella cultura queste cellule permettono studi sui meccanismi di risposta o di resistenza al trattamento anti-angiogenico. Recentemente, è stato trovato che TECs isolata da carcinoma umano del colon-retto (CRC) Mostra memoria-come gli effetti basati sulla TME specifici sono stati derivati da. Inoltre, questi TECs contribuire attivamente alla creazione di una specifica TME dalla secrezione di fattori diversi. Ad esempio, TECs in una Th1-TME prognosticamente favorevole secernere la proteina tumore-soppressiva fattore secernuto anti-angiogenici, acida e ricca di cisteina-simile 1 (SPARCL1). SPARCL1 regola l’omeostasi nave e inibisce la migrazione e la proliferazione delle cellule tumorali. Quindi, culture di TECs puro, praticabile, isolato da tumori solidi umani sono uno strumento prezioso per gli studi funzionali sul ruolo del sistema vascolare nella tumorigenesi. Qui, un nuovo protocollo sono aggiornato per l’isolamento primaria CE da colon normale nonché CRC è descritto. La tecnica si basa sulla digestione meccanica ed enzimatica del tessuto, immunolabeling e delle cellule attivate la fluorescenza che ordinano (FACS)-ordinamento delle cellule triple-positive (CD31, VE-caderina, CD105). Con questo protocollo, TEC praticabile o colture di cellule endoteliali normali (NEC) potrebbero essere isolati dai tessuti del colon con un tasso di successo di 62,12% quando sottoposti a cernita FACS (41 colture pure CE da 66 campioni di tessuto). Di conseguenza, questo protocollo fornisce un approccio efficace per isolare culture umane CE da normale del colon e CRC.

Introduction

Il microambiente tumorale (TME) è definito come una stretta interazione delle cellule del tumore con lo stroma del tumore, che è composto di cellule come le cellule endoteliali (CE), periciti, fibroblasti, cellule muscolari lisce o cellule del sistema immunitario. La comunicazione tra questi compartimenti cellulari può essere guidata da fattori paracrini (ad es., fattori di crescita angiogenici, citochine), dalla matrice extracellulare, o contatto diretto cellula-cellula. Il compartimento stromale può favorire o contrastare l’inizio del tumore o la progressione, a seconda della TME specifico stabilito.

La possibilità di un tumore di connettersi con il sistema del vaso è la chiave per la progressione e la metastasi della malattia. Il sistema del vaso permette il tumore principalmente ottenere l’accesso per la consegna di ossigeno e nutrienti, nonché la rimozione di prodotti di scarto1,2,3. CE costituiscono la superficie interna dei vasi e sono quindi importanti componenti cellulari che partecipano attivamente a questo processo. È noto che cellule endoteliali tumorali (TEC) sono diverse da loro corrispondenti cellule endoteliali normali (NEC) di molte caratteristiche come disturbato gerarchia dell’albero vascolare, permeabilità del vaso, o ridotta maturazione come esemplificato da un ridotto numero di cellule di periciti/murale soltanto senza bloccare collegati al CE4.

Quindi, TECs sono strumenti preziosi cellulari per lo studio di carcinogenesi. TECs principalmente sono stati considerati per promuovere la crescita e la progressione di tumore3. Così, TECs può essere utilizzato come biosensori che consentono il monitoraggio e l’identificazione dei processi patogeni che avviano, favorire o contrastare la tumorigenesi. Inoltre, essi sono bersagli terapeutici in clinica5. Di conseguenza, TECs isolato e CNE corrispondente possono anche essere utilizzati come strumenti per comprendere i meccanismi di risposta o di resistenza al trattamento anti-angiogenico.

In passato, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare queste cellule6,7 e identificato che TECs non sono solo diverse da CNE, ma inoltre differiscono tra loro a seconda della TME sono stati derivati da8. Attraverso questo approccio, è stato dimostrato che TECs in determinate TMEs può contrastare attivamente la crescita del tumore e la progressione dalla secrezione di proteine tumore-soppressiva di anti-angiogenici come SPARCL1. Ciò ha indicato che TECs stanno contribuendo attivamente all’istituzione di una TME prognosticamente favorevole nel carcinoma colorettale umano (CRC)8.

Gli studi precedenti ha tentato di isolare TECs umana da tumori solidi. Un obiettivo importante di questi studi era, per esempio, l’identificazione di nuovo tumore delle cellule endoteliali marcatori (TEMs)9. Una strategia di utilizzo immediato di TECs dopo microdissezione laser è stato applicato al fine di evitare l’alterazione o la perdita del fenotipo TEC nella cultura. Tuttavia, gli studi di follow-up identificato una popolazione contaminante delle cellule murale come un grave inconveniente di questo approccio10. Il nostro laboratorio è stato il primo a sviluppare un protocollo che ha permesso l’isolamento di TECs puro, praticabile da umano CRC pazienti6,7. È stato scelto un approccio con più cicli di selezione (MACS) cella magnetico di TECs che assicurava ad alta purezza delle culture CE isolate. Tuttavia, questo approccio ha richiesto un periodo di coltivazione relativamente lungo (6 settimane in media), che ha aumentato il rischio di manufatti indotta da cultura. Quindi, nel passaggio successivo, lo scopo era di ridurre il tempo di coltivazione fra chirurgia e la raccolta della prima cultura pura. Per raggiungere questo obiettivo, un protocollo migliorato impiegando una dissociazione combinato enzimatici basati e meccanica del tessuto del tumore iniziale, seguita da celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS)-ordinamento della tripla-con l’etichetta CE, è stato sviluppato. Questo ridotto tempo di isolamento in media per tre settimane, con conseguente colture pure di TEC e NEC con maggiore redditività per studi funzionali. Isolamento delle colture pure di TEC e NEC praticabile da tessuti umani con alte percentuali di successo può aprire nuove vie per paziente-specifici droga test durante lo sviluppo di regimi di terapia individualizzata. L’approccio di isolamento è dettagliato nei paragrafi seguenti.

Protocol

Il processo di isolamento è stato approvato dal comitato etico locale della University Medical Center Erlangen (n. 159_15 B, TuMiC-Studio). Criteri di inclusione paziente erano come segue: CRC, UICC tappa-IV, senza la storia della malattia di viscere infiammatoria e nessun trattamento neoadiuvante. 1. chirurgia e preparazione di tessuti per isolamento di singole cellule Ottenere campioni di chirurgia da un paziente CRC (tessuto di carcinoma > 0,5 g, centrali del tumore non-necrotici; tessuto normale del colon > 10 cm distanti dal sito del tumore). I pezzi di tessuto ottenuti sono per lo più 1 g per il colon normale. Se pezzi > 1G sono ottenuti, dividerli in più parti di 1g usando un bisturi fresco per un’ulteriore elaborazione del tessuto.Nota: Se il pezzo di tessuto del tumore è inferiore a 0,5 g fin dall’inizio, l’isolamento di solito non riesce. Raccogliere freschi non fissati pezzi di tessuto usando pinze sterili in 40 mL di ghiaccio freddo Hanks equilibrata soluzione salina (HBSS) completati con penicillina/streptomicina/amphothericin B (1% HBSS-penna/mal/ampho) in provette da centrifuga da 50 mL e trasferirli rapidamente alla laboratorio.Nota: Tessuto dei due punti è spesso altamente contaminato con batteri/funghi fin dall’inizio. Durante l’intera procedura di isolamento, penna/mal/ampho deve essere aggiunto a tutte le soluzioni al fine di eliminare microrganismi contaminanti. Lavare ogni pezzo di tessuto almeno 4 volte con 40 mL di ghiaccio freddo HBSS-penna/mal/ampho (Vedi punto 1.3) in provette da centrifuga da 50 mL trasferendo i pezzi di tessuto in sequenza da una provetta per il tubo successivo utilizzando pinze sterili. Forcipe pulito dopo ogni passaggio con etanolo al 70%. Utilizzare pinze separate per il carcinoma e pezzi di tessuto normale del colon. Pesare tutti i pezzi di tessuto.Nota: Non mettere pezzi di tessuto direttamente su una scala per la pesatura. Dopo il lavaggio, pesare l’ultima provetta da centrifuga contenente il tessuto prima e dopo aver inserito i pezzi di tessuto. Calcolare il peso dei pezzi di tessuto per sottrazione. 2. generazione di sospensione unicellulare Nota: Si consiglia di mantenere il tessuto idratato in ogni momento. Se presente, rimuovere grasso allegata, altri tessuti non tumorali o parti di tessuto necrotico potenzialmente dall’esemplare chirurgia trasferendo i pezzi di tessuto in una capsula di Petri sterile cella cultura utilizzando pinze sterili. Tenere i pezzi di tessuto idratati a tutte le volte con l’aggiunta di 3-5 mL di HBSS-penna/mal/ampho. Tagliare i pezzi di tessuto usando un bisturi sterile fresco (Figura 1). Consultare un patologo in caso di identificazione di tessuto è poco chiaro. Tritare il tessuto restante in piccoli pezzi (circa 2 × 2 × 2 mm3) usando un bisturi fresco con una lama curva. Trasferimento di pezzi di tessuto con pinze sterili in provette di dissociazione del tessuto (ad esempio, tubi di gentleMACS C) pre-riempite con pre-riscaldata (37 ° C) medium di coltura cellulare (Dulbecco´s modified eagle [DMEM] basale Media) secondo il produttore istruzioni.Nota: Provare a utilizzare il bisturi come uno strumento a dondolo. Non strizzare le cellule al fine di evitare danni ai tessuti. Digest/dissociare pezzi tessuto utilizzando un dissociatore di tessuto (come gentleMACS Octo dissociatore) in combinazione con il kit di dissociazione del tumore per tessuto umano utilizzando le istruzioni del programma “37C_h_TDK_1” seguendo il possible. Centrifugare le provette di dissociazione per 1 min a 300 x g a temperatura ambiente (TA). Aggiungere 10 mL di pre-riscaldato (37 ° C) DMEM completate con 0,5% siero bovino fetale (FBS) (DMEM-basso) in ogni provetta utilizzando una pipetta sierologica e filtrare la sospensione cellulare utilizzando un colino di cella (dimensione dei pori di 100 µm) sulla cima di una provetta da centrifuga da 50 mL pipettando cella sospensione sulla parte superiore del filtro. Aggiungere 10 mL di DMEM-basso ancora una volta per ogni Mac-tubo mediante una pipetta sierologica e trasferire le cellule rimanenti al filtro cella sulla parte superiore della provetta da centrifuga da 50 mL. Lavare il filtro cella una volta con un ulteriore 10 mL di DMEM-bassa media utilizzando una pipetta sierologica. Centrifugare la sospensione cellulare per 7 min a 300 x g a RT ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 5 mL di sostanza basale endoteliale pre-riscaldato (EBM) -2-microvascolare medium (MV) (Lonza) completate con penna/mal/ampho nella stessa provetta da centrifuga da 50 mL. Sospensione di cellule di piastra in un matraccio di cultura cellulare T-25 preverniciato durante la notte con 1,5% gelatina-tamponato fosfato salino (PBS) a 37 ° C con 5% CO2. Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C e 5% CO2, lavare le cellule due volte con attenzione con circa 5 mL di PBS e aggiungere 5 mL di terreno nuovo. Coltivare le cellule a 37 ° C e 5% CO2 fino al confluency di 80-90% (di solito 5-7 giorni) con intervalli di 48 h di rinnovamento medio. 3. FACS-ordinamento delle cellule endoteliali Nota: Cercate di evitare la perdita di cellule in qualsiasi punto, ad esempio limitando la procedura di colorazione per incubazione delle cellule in un tubo singolo reagente. Staccare le cellule con 1 mL di accutase (circa 10 min) e aggiungere 4 mL di terreno di EBM-2-MV pre-riscaldata (37 ° C). Determinare il conteggio delle cellule utilizzando una cella automatizzata anomala (intervallo 10-25 µm). Centrifugare la sospensione cellulare per 4 min con 250 x g a RT ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in pre-riscaldato FACS-buffer (1x PBS, il 2,5% di sieroalbumina bovina [BSA], pH di 5 mM EDTA 8.0, 10 µM Y-27632) secondo il conteggio delle cellule (5 x 106/ml). Aggiungere FACS-macchiatura anticorpi secondo volume delle cellule totali/FACS-buffer: CD31-FITC (100 µ l/mL = 1/10), CD144/vascolare endoteliale (VE) – cadherin – PE (100 µ l/mL = 1/10), CD105-APC (25 µ l/mL = 1/40), miscelare e incubare per 7 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce; delicatamente flick e incubare per un altro 8 min (per un tempo totale di incubazione di 15 min). Aggiungere 2 mL di buffer di FACS alla sospensione cellulare con etichetta utilizzando una pipetta sierologica. Centrifugare per 4 min con 250 x g a RT e gettare il surnatante. Lavare due volte con l’aggiunta di 2 mL di buffer di FACS e condurre una successiva centrifugazione per 4 min a 250 x g a RT e gettare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 µ l di pre-riscaldato EBM-2-MV-penna/mal/ampho e cellule di trasferimento allo strumento FACS-ordinamento. Cellule endoteliali moriranno rapidamente durante il processo di ordinamento se il FACS-strumento è raffreddato. Pertanto, eseguire l’ordinamento delle cellule endoteliali a RT e trasferire immediatamente le cellule raccolte nell’incubatore a 37 ° C in seguito.Nota: Lo strumento di FACS è solitamente non sterile! Cellule di triple-positive di sorta/raccogliere direttamente in una piastra di coltura delle cellule (per esempio, 24 pozzetti piastra multistrip durante la notte con 1,5% gelatina-PBS) riempito con 0,5 mL di terreno nuovo pre-riscaldato (EBM-2-MV-penna/mal/ampho).Nota: Controllare la sospensione cellulare dopo l’ordinamento utilizzando un microscopio. Se le cellule si raggruppano, tenta di ottenere una distribuzione uniforme delle cellule nella piastra di coltura cellulare mescolandoli lentamente o aggiungendo medio. Coltivare cellule fino al confluency di 90-100% con intervalli di 48 h di rinnovamento media ed espandere le cellule per le dimensioni del piatto di cultura desiderata (piastra a 24 pozzetti → 12-pozzetti → 3,5 cm piatto → T-25 → T-75). 4. raccolta e caratterizzazione di cellule endoteliali Pure Raccogliere le cellule al 90-100% confluency e li caratterizzano mediante un metodo appropriato (ad es., FACS, Citochimica, reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) o delle cellule endoteliali funzione saggi7,8). Analizzare le cellule isolate con qualsiasi metodo di caratterizzazione è scelto.

Representative Results

L’isolamento di NEC e TEC da CRC umana di una dissociazione combinato meccanico/acidica del tessuto, seguita da successive CD31/CD105/VE-caderina-driven FACS-ordinamento è descritto qui (Figura 1A). Questo protocollo rappresenta un protocollo migliorato con una finestra di tempo ridotto fino al primo raccolto delle cellule endoteliali pure, praticabile rispetto al precedente protocollo basato su Mac7. NEC e TEC sono stati isolati da CRC umano attenendosi alla seguente procedura: (1) generazione di una sospensione unicellulare di dissociazione combinata meccanica ed enzimatica del tessuto e la crescita di queste cellule al confluency di 80-90% (Figura 1), (2) triple etichettatura della CE di anticorpi fluorocromo-accoppiato CD31/CD105/VE-caderina e (3) FACS-ordinamento delle rispettive cellule triple-positive (Figura 2A). Di nota, un passo fondamentale per il successo della procedura di isolamento e la vitalità delle cellule è rapidamente soggetti l’esemplare di chirurgia per la procedura di isolamento (generazione di sospensione unicellulare < 1 ora dopo resezione). Utilizzando FACS-ordinamento, una media di 12.500 TEC (n = 12) e 17.800 NEC (n = 12, Figura 2B, sinistra) che rappresenta una media di 3,6 e il 5,6% della popolazione totale delle cellule (Figura 2B, destra) potrebbe essere isolato. Successivamente, le cellule sono state ampliate fino a T-75 (chiamato passaggio 1) e raccolto o successivamente trattato per analisi. Della nota, utilizzando il protocollo precedente basato su Mac, è stato raggiunto un successo di isolamento medio del 49,6% (n = 58 TECs puro da n = 117 pazienti8) con puro CE culture disponibile mediamente 6 settimane dopo la chirurgia. Usando il nuovo protocollo basato su FACS descritto qui, le prime colture di CE pure sono state ottenute in media 3 settimane dopo l’intervento chirurgico con un tasso di successo di isolamento del 62,1% (n = 41 colture pure di CE ottenute da n = 66 singole cellule sospensioni sottoposti a cernita FACS). Di conseguenza, un aumento del tasso di isolamento del 12,5% è stato raggiunto in parallelo con una diminuzione del tempo di coltivazione da 6 a 3 settimane. Questa riduzione del tempo di coltivazione hanno portato a vitalità cellulare migliore e prolungata durata accompagnata da minore esposizione all’induzione di potenziali dipendenti dalla cultura manufatti delle culture stabilite. Caratterizzazione di purezza CE è stata condotta prima di CD31-citochimica (Figura 3A). Se le culture erano privi di cellule di CD31-negative (Figura 3A, TEC e NEC), sono stati sottoposti a una cella più dettagliata digitando da reazione a catena della polimerasi quantitativa trascrizione inversa (RT-qPCR) (Figura 3B). Sono stati utilizzati primers specifici del tipo di cella per CE (CD31, CD105, VE-caderina e von Willebrand factor [vWF]), leucociti (CD45), cellule epiteliali (cytokeratin [CK] -20) e cellule di muscolo liscio/fibroblasti (desmin) (Figura 3B). Utilizzando questa cella basata su qPCR digitando, una potenziale contaminazione delle culture CE da altre celle dell’intervallo di 0,1 – 2%, a seconda del tipo di cellula, può essere rilevato8. In particolare, precedentemente abbiamo segnalato una perdita preferenziale di espressione della proteina di sindrome di Raynaud in TEC culture rispetto ai loro corrispondenti NEC culture7. Questi risultati potrebbero essere confermati con il protocollo di isolamento neoformata (Figura 3C, significa perdita di Ct NEC-TEC = 0.687, p = 0.173, t-prova accoppiata). Culture, superato con successo questi controlli di qualità sono state testate per infezione del micoplasma e successivamente utilizzate per ulteriori esperimenti. Figura 1 : Cellule endoteliali pure possono essere isolate dal colon umano normale e CRC ordinando FACS. (A) diagramma di flusso delle tappe fondamentali del processo di isolamento CE. (B) (giallo), altre parti non-tumorale, o parti di tessuto necrotico potenzialmente (marrone) sono stati rimossi dall’esemplare della chirurgia (pannello di sinistra e centrale) ed il tumore era disintegrato in cubetti di 2-3 mm di lunghezza lato prima del tessuto dissociazione (tessuto adiposo Pannello di destra). (C), la singola cella sospensione estratto dopo dissociazione del tessuto (pannello di sinistra) è stato incubato per 24 h in piastre di coltura delle cellule. Successivamente, le cellule non-aderenti sono stati rimossi per lavaggio delicato con PBS (pannello centrale) e le cellule sono state coltivate per confluency di 80-90% prima dell’ordinamento FACS (pannello di destra). Immagini del pannello inferiore (C) sono state acquisite da microscopia di contrasto di fase. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Una media di 3,6-5,6% della sospensione delle singole cellule isolate da pazienti affetti da CRC e filtrate FACS erano triple-positivi EC. (A) NEC e TEC erano FACS-ordinati utilizzando una tripla etichettatura delle cellule con anticorpi anti-CD31, – CD105 e – VE-caderina. (B) una media di 12.500 TECs (n = 12) e 17.800 CNE (n = 12) possono essere isolati dal colon umano normale o CRC usando FACS-ordinamento (celle CD31, CD105 e VE-caderina-positivo, pannello sinistro), che rappresenta in media 3.6 e 5,6% (pannello di destra) della cella totale popolazione occupata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : NEC e TEC da CRC umani esprimono marcatori tipici delle cellule endoteliali. Cellule endoteliali del colon normale (NEC, n = 10) e cellule endoteliali tumorali (TEC, n = 10) da CRC umano sono CD31 (marcatore di CE)-, CD105 (marcatore di CE)-, VE-caderina (marcatore CE)-, sindrome di Raynaud (marcatore CE) – positivo e CK20 (indicatore di cella CRC)-, desmina (indicatore del fibroblasto/SMC)-, CD45 ( marcatore del leucocita)-negativo come determinato da (A) CD31-immunocitochimica (cellule positive = rosso) e (B) RT-qPCR (dati punti sotto la linea tratteggiata sono campioni rilevati essere negativo). Espressione di sindrome di Raynaud (C) come determinato da RT-qPCR per campioni TEC/NEC corrispondenti dagli stessi pazienti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Principalmente, tre diversi metodi sono stati impiegati finora per isolare puro e vitale CNE e TECs da tessuti umani solidi, vale a dire (1) immunomagnetica arricchimento, microdissezione laser (2) e (3) FACS-ordinamento della frazione CE. Nella maggior parte delle pubblicazioni, immunomagnetica arricchimento delle cellule dopo la generazione di una sospensione unicellulare di disintegrazione meccanica era usato11,12,13. Ad esempio, immunomagnetica purificazione di umano cutaneo microvascolare CE (HDMEC) di E-selectin anticorpi dopo il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α trattamento da neonatale prepuzi13 è stato segnalato per l’isolamento di umana CE da glioma dal tessuto digerire, gradiente di percoll e selezione utilizzando anti-CD31/CD105 e VE-caderina-anticorpi12, o dagli anticorpi anti-CD105 da umano seno carcinoma11. Protocolli che impiegavano microdissezione laser o FACS-ordinamento sono stati riportati meno frequentemente. Microdissezione laser è stato utilizzato, per esempio, per identificare potenziale pan-tumore marcatori delle cellule endoteliali (TEMs) CE derivate da carcinoma colorettale umano con l’analisi delle cellule immediatamente dopo dissezione9. FACS-ordinamento utilizzando anti-CD31-anticorpi è stato dimostrato con successo per l’isolamento della frazione CE da embrionali indifferenziate umane cellule staminali14.

Questi approcci presentano diversi vantaggi e svantaggi che devono essere considerati. I vantaggi per l’approccio basato su immunomagnetica sono che non è necessario nessun equipaggiamento elaborato, la selezione può essere effettuata in qualsiasi momento e l’arricchimento delle cellule è veloce (circa 15 min) rispetto al FACS-ordinamento (circa 1h). La mancanza di matrice per un periodo di tempo più lungo può indurre la morte delle cellule della CE di anoikis. Pertanto, aggiunta dell’inibitore della chinasi rho Y-27632 nel buffer di FACS è stato impiegato per impedire la cella anoikis15.

Gli svantaggi di arricchimento immunomagnetica sono che più cicli di selezione sono necessari al fine di raggiungere la purezza superiore al 99%. Inoltre, colture cellulari tra arricchimenti sono necessaria per il recupero delle cellule, che aumenta l’età delle culture sostenere manufatti indotta da cultura. Microdissezione laser ha il vantaggio che le cellule possono essere utilizzati immediatamente che riduce indotta da cultura manufatti ma include il rischio di contaminazione da parte di cellule dal tessuto adiacente zone10. Inoltre, microdissection non è stabilito in ogni laboratorio. Gli svantaggi dell’approccio FACS-ordinamento-base includono, simile al laser microdissection, che l’apparecchiatura è elaborati e costosi. Di conseguenza, questa apparecchiatura può non essere accessibile in qualsiasi momento. In una regolazione clinica, dove la disponibilità del tessuto di interesse non può essere prevista esattamente, questo può aggiungere un ulteriore svantaggio.

Tuttavia, i vantaggi principali di FACS-ordinamento sono che la frazione di CE possa essere etichettata dagli anticorpi multipli in parallelo. Così, una strategia di gating severe può essere impiegato che garantirà un’elevata purezza. Basato su esperienza, nessun re-ordinamento della frazione CE è stato richiesto, in contrasto con il precedente protocollo basato su Mac dove tondi multipli di selezione dovevano essere impiegato. Ciò ha condotto ad un tempo significativamente ridotta coltivazione fino alla purezza da sei settimane (approccio MACS) per tre settimane nell’approccio FACS, conseguente a un’attivazione di una finestra di tempo prolungato di analisi la vitalità cellulare migliorata. Infine, utilizzando la strategia di FACS-ordinamento-basato, un miglioramento del tasso di successo globale di isolamento potrebbe essere raggiunto (aumento del 12,5%). In conclusione, il FACS-ordinamento basato strategia impiegando 3 anticorpi in parallelo dopo digerire tessuto tramite digestione combinata meccanica ed enzimatica del tessuto ha avuto numerosi vantaggi che ha stabilito questo protocollo come il metodo di scelta per l’isolamento di TECs e CNE da umane di carcinoma del colon-retto e del colon.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (divisione di molecolare e chirurgia sperimentale), Uwe Appelt, Michael Mroz (Core unità FACS-ordinamento) e Simon Völkl (Core unità FACS-Immunomonitoring) per l’eccellente assistenza tecnica. Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni a EN/MS del centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) della University Medical Center Erlangen, German Research Foundation (DFG: per 2438, SP2) e Lutz-Stiftung, da una sovvenzione della Fondazione Robert-Pfleger-Stiftung a VSS, come pure di sovvenzioni conferite a MS da German Research Foundation [DFG: KFO257 (sottoprogetto 4), SFB 796 (Sub-progetto B9)].

Materials

HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP
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References

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Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).
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