JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

בידוד של תאי אנדותל אדם נורמלי המעי הגס, סרטן המעי הגס - פרוטוקול משופר

Published: April 04, 2018
doi:
10.3791/57400
, , , , , , , , ,
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg

Summary

גידול תאי אנדותל הם גורמים חשובים של microenvironment הגידול הקורס של המחלה. כאן, עבור בידוד תאי אנדותל טהורה ובת -קיימא מן האנושי קרצינומה של המעי הגס והמעי הגס רגיל כדי לשמש בדיקות סמים ומחקר פתוגנזה פרוטוקול המתואר.

Abstract

ראשי תאים מבודד מן האדם קרצינומות הם הכלים החשובים כדי לזהות פתוגניים המנגנונים תורם מחלת התפתחות והתקדמות. בפרט, תאי אנדותל (EC) המהוות את השטח הפנימי של כלי, ישירות להשתתף חמצן משלוח אספקת מזונם, סילוק חומרי פסולת, של גידולים, ומעורבים באופן בולט ובכך בחוקה של הגידול microenvironment (טיים). גידול תאי אנדותל (אקדח) יכול לשמש ביולוגיים הסלולר של microenvironment intratumoral שהוקם על ידי התקשורת בין גידול תאי סטרומה. אקדח גם לשמש מטרות הטיפול. בהתאם לכך, בתרבות תאים אלה מאפשרים מחקרים על מנגנוני תגובה או התנגדות לטיפול אנטי-אנגיוגנזה. לאחרונה, נמצא כי אקדח מבודד קרצינומה של המעי הגס האנושי (CRC) התערוכה זיכרון אפקטי בהתבסס על טיים ספציפיים הם נגזרו. יתר על כן, אקדח אלה באופן פעיל לתרום הקמת טיים ספציפית על ידי ההפרשה של גורמים שונים. לדוגמה, אקדח ב Th1-טיים prognostically חיובית מפרישים החלבון פקטור גידול מדכאים מופרש אנטי-אנגיוגנזה, חומצי ועשיר כמו ציסטאין 1 (SPARCL1). SPARCL1 מווסת את כלי השיט הומאוסטזיס, ומעכב התפשטות תאים סרטניים והעברה. לפיכך, תרבויות טהור, קיימא אקדח מבודד מן האדם גידולים מוצקים הם כלי חשוב ללימודי פונקציונלי על תפקידה של מערכת כלי הדם ב- tumorigenesis. . הנה, עבור הבידוד של EC העיקרי של המעי הגס נורמלי וכן CRC פרוטוקול עדכני חדש מתואר. הטכניקה מבוססת על עיכול רקמת מכני, אנזימטי, immunolabeling תא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS)-מיון תאי טריפל-חיובי (CD31, VE-קדהרין, CD105). עם פרוטוקול זה, טק קיימא או תרביות תאים נורמליים אנדותל (NEC) יכול להיות מבודד מן המעי הגס רקמות עם שיעור הצלחה של 62.12% כאשר נתון FACS-מיון (41 טהור EC של תרבויות דגימות רקמה 66). בהתאם לכך, פרוטוקול זה מספקת גישה חזקה כדי לבודד התרבויות האנושיות EC מן המעי הגס נורמלי CRC.

Introduction

Microenvironment הגידול (טיים) מוגדרת של אינטרקציה קרובה של תאים סרטניים עם הגידול stroma, אשר מורכב של תאים כמו תאי אנדותל (EC), pericytes, fibroblasts, תאי שריר חלק או תאים חיסוניים. התקשורת בין תאים סלולריים אלה יכול להיות מונע על ידי גורמים paracrine (למשל, גורמי גדילה אנגיוגנזה, ציטוקינים), על ידי מטריצה חוץ-תאית, או קשר ישיר תאים תאים. תא סטרומה פוסטר או לנטרל חניכה הגידול או התקדמות, בהתאם טיים ספציפי הוקמה.

היכולת של הגידול להתחבר עם מערכת כלי הוא מפתח התקדמות, גרורה של המחלה. מערכת כלי השיט מאפשר את הגידול בעיקר לקבל גישה המסירה של חמצן וחומרים מזינים, כמו גם את סילוק הפסולת1,2,3. EC מהווים השטח הפנימי של כלי, ולכן הם מרכיבים חשובים הסלולר להשתתף באופן פעיל בתהליך זה. ידוע היטב כי גידול תאי אנדותל (TEC) שונים שלהם המתאימים אנדותל בתאים נורמליים (NEC) על-ידי תכונות רבות כגון היררכיה מופרע של העץ כלי דם, כלי leakiness, או מופחתת ההבשלה כפי שהיא מוסברת על ידי מספר מופחת תאים pericytes/קיר שמצורפים רק באופן רופף ה EC4.

לפיכך, אקדח הם כלי רב ערך הסלולר ללמוד carcinogenesis. אקדח נחשבו בעיקר לטפח את הגידול התקדמות וצמיחה של3. לפיכך, אקדח יכול לשמש גם ביולוגיים המאפשרים את ניטור וזיהוי תהליכים פתוגניים ליזום, פוסטר או לנטרל tumorigenesis. יתר על כן, הם מטרות טיפוליות מרפאת5. כתוצאה מכך, אקדח מבודד ו- NECs המתאימים עשוי לשמש גם ככלים כדי להבין את מנגנוני תגובה או התנגדות לטיפול אנטי-אנגיוגנזה.

בעבר, אנו פיתחו פרוטוקול לבודד תאים אלה,6,7 , זיהו כי אקדח אינם שונים NECs, אבל גם שונים אחד מהשני בהתאם טיים הם נגזרו8. באמצעות גישה זו, זה הוצג אקדח ב TMEs מסוימים יכולים לנטרל באופן פעיל התקדמות וצמיחה של הגידול על ידי הפרשת חלבונים אנטי-אנגיוגנזה הגידול מדכאים כגון SPARCL1. זה יצוין כי אקדח תורמות באופן פעיל להקמת טיים prognostically חיוביות קרצינומה של המעי הגס האנושי (CRC)8.

מחקרים קודמים ניסו לבודד את אקדח האנושי של גידולים מוצקים. מטרה חשובה של מחקרים אלו היה, למשל, זיהוי חדש גידול תאי אנדותל סמנים (TEMs)9. אסטרטגיה של שימוש מיידי של אקדח לאחר לייזר microdissection היה מוחל על מנת למנוע שינוי או אובדן פנוטיפ TEC בתרבות. עם זאת, מחקרי מעקב זיהו אוכלוסיה ההרסנית של תאים ציור קיר כמו חיסרון רציני של גישה זו10. המעבדה שלנו היה הראשון לפתח פרוטוקול אשר איפשר את ניתוקה של אקדח טהור, קיימא האנושי CRC חולים6,7. גישה עם מספר סיבובים הבחירה (מקינטוש) תא מגנטי של אקדח זה הבטיחו טוהר גבוהה של התרבויות EC מבודד נבחר. עם זאת, גישה זו נדרשת תקופה טיפוח ארוכות יחסית (6 שבועות בממוצע), אשר הגדיל את הסיכון של חפצי תרבות-induced. לפיכך, בשלב הבא, המטרה היתה לצמצם את הזמן לטיפוח בין ניתוח לבין הקציר של התרבות טהור הראשון. כדי להשיג מטרה זו, פרוטוקול משופרת העסקת דיסוציאציה בשילוב רקמה מכנית, מבוסס על אנזימטי של הגידול הראשוני, ואחריו תא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS)-מיון של התווית על-ידי שלוש פעמים EC, פותחה. זה למצב בידוד זמן בממוצע שלושה שבועות, וכתוצאה מכך תרבויות TEC ו- NEC טהור עם הכדאיות מוגברת ללימודי פונקציונלי. בידוד של טהור קיימא TEC ו- NEC של תרבויות רקמות עם אחוזי הצלחה גבוהים עשוי לפתוח אפיקים חדשים בדיקות במהלך הפיתוח של טיפול בפעוט משטרי סמים החולה הספציפי. הגישה בידוד מפורט בפיסקאות הבאות.

Protocol

תהליך בידוד אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת ארלנגן מרכז רפואי (#159_15 B, TuMiC-לימוד). קריטריוני ההכללה המטופל היו כדלקמן: CRC, UICC שלב I-IV, אין עבר של מחלות מעי דלקתיות, אין טיפול neoadjuvant. 1. ניתוח והכנה של רקמות לבידוד תא בודד להשיג דגימה על ידי ניתוח של מטופל CRC (קרצינומה של רקמות > 0.5 g, הגידול ללא נמק מרכזי; הרקמות המעי הגס > 10 ס”מ רחוק מאתר הגידול). החלקים רקמות שהושג בעיקר 1 g למעי הגס נורמלי. אם חתיכות > 1 g מתקבלים, לפצל אותם לחתיכות 1 g מרובים באמצעות אזמל טריים לעיבוד נוסף של רקמות.הערה: אם החלק רקמת הגידול הוא מתחת 0.5 ג’י שמראש, הבידוד בדרך כלל תיכשל. מבולבל טריים לאסוף פיסות רקמה באמצעות מלקחיים סטרילית 40 מ”ל של קרח הנקס קר מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) בתוספת סטרפטומיצין/פניצילין/amphothericin B (1% HBSS-עט/דלקת/ampho) 50-mL צנטריפוגה צינורות ולהעביר אותם ובמהירות מעבדה.הערה: רקמת המעי הגס לעתים קרובות מאוד מזוהם עם חיידקים/פטריות שמראש. במהלך כל התהליך של בידוד, עט/דלקת/ampho להתווסף כל הפתרונות כדי לחסל את אורגניזמים מזהמים. לשטוף כל פיסת רקמה לפחות 4 פעמים עם קרח 40 מ”ל קר HBSS-עט/דלקת/ampho (ראה שלב 1.3) 50-mL צנטריפוגה צינורות על ידי העברת את חתיכות רקמה ברצף מהצינור צנטריפוגה אחד אל הצינור הבא באמצעות מלקחיים סטרילי. מלקחיים נקיים לאחר כל שלב עם 70% אתנול. להשתמש מלקחיים נפרדים עבור קרצינומה של חתיכות נורמלי של רקמת המעי הגס. שוקלים את כל החלקים רקמות.הערה: אין לשים חתיכות רקמה ישירות על סרגל במשקל. לאחר הרחצה, לשקול את הצינור צנטריפוגה האחרון המכיל את הרקמה לפני ואחרי הזנת את חתיכות רקמה. לחשב את המשקל של חתיכות רקמה בודדים על-ידי חיסור. 2. דור של תא בודד השעיה הערה: מומלץ לשמור את הרקמה לחות בכל עת. אם הוא קיים להסיר שומן המצורפת, רקמת tumorous אחרים או רקמת נמק שעלולים חלקים מן הדגימה ניתוח על ידי העברת את חתיכות רקמה בצלוחית תא סטרילי תרבות באמצעות מלקחיים סטרילי. שמור את חתיכות רקמה לחות בכל עת על-ידי הוספת 3-5 מ של HBSS-עט/דלקת/ampho. חתוך את חתיכות רקמה באמצעות אזמל סטרילי טריים (איור 1). התייעץ עם הפתולוג למקרה זיהוי הרקמה אינה ברורה. מינצ רקמות הנותרים לחתיכות קטנות (כ 2 × 2 × 2 מ מ3) באמצעות אזמל טריים עם להב מעוקל. להעביר את חתיכות רקמה עם מלקחיים סטרילי לתוך רקמות דיסוציאציה צינורות (לדוגמה, צינורות gentleMACS C) מראש מלא מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס) תא תרבות בינוני (Dulbecco´s שונה נשר בינונית [DMEM] הבזליים בינוני) לפי היצרן הוראות.הערה: נסה להשתמש את האזמל כמו כלי נדנדה. לא לסחוט את התאים על מנת למנוע נזק לרקמות. תקציר/מביצועם רקמות חתיכות באמצעות של רקמה dissociator (כמו gentleMACS Octo Dissociator) בשילוב עם ערכת דיסוציאציה גידול רקמות אנושיות תוך שימוש בהוראות התוכנית “37C_h_TDK_1” בעקבות manufacturer´s. צנטריפוגה דיסוציאציה צינורות עבור 1 דקות ב- g x 300 בטמפרטורת החדר (RT). להוסיף 10 מ של טרום ומחוממת (37 ° C) DMEM בתוספת 0.5% עוברית שור סרום (FBS) (DMEM-נמוך) על כל שפופרת באמצעות פיפטה סרולוגית ולסנן התליה תא באמצעות מסננת תא (100 מיקרומטר גודל הנקבוביות) על גבי שפופרת צנטרפוגה 50-mL pipetting התא השעיה על המסנן. להוסיף 10 מ של DMEM-נמוך שוב כל מקינטוש-שפופרת באמצעות פיפטה סרולוגית ולהעביר בתאי שנותרה התא מסננת על גבי הצינור 50-mL צנטריפוגה. לשטוף את מסננת תא פעם אחת עם אוטם 10 נוספים של DMEM-נמוכה בינונית בעזרת פיפטה סרולוגית. Centrifuge התליה תא במשך 7 דקות ב g x 300-RT ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend התאים ב- 5 מ של טרום ומחוממת בינוני הבזליים אנדותל (EBM)-2-בינוני (MV) microvascular (Lonza) בתוספת עט/דלקת/ampho לשפופרת 50-mL צנטריפוגה אותו. צלחת ההשעיה תא בבקבוקון T-25 תא תרבות מראש מצופה בן לילה בתמיסת ג’לטין-פוספט buffered 1.5% (PBS) ב 37 ° C עם 5% CO2. דגירה תאים עבור 24 שעות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, לשטוף את התאים פעמיים בזהירות עם-5 מ של PBS ולהוסיף 5 מיליליטר בינוני טריים. לטפח את התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד 80-90% confluency (בדרך כלל 5-7 ימים) עם 48 שעות במרווחי זמן של התחדשות בינוני. 3. FACS-מיון תאי אנדותל הערה: לנסות למנוע איבוד תאים בשלב כלשהו, למשל על-ידי הגבלת ההליך מכתימים דגירה של התאים בשפופרת מגיב יחיד. ניתוק תאים עם 1 מ”ל של accutase (כ- 10 דקות), וכן להוסיף 4 מיליליטר בינוני EBM-2-MV ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס). לקבוע את ספירת התאים באמצעות תא אוטומטיות ספירת ההתקנים (מיקרומטר בטווח 10-25). תגובת שיקוע צנטריפוגה תא השעיה במשך 4 דקות עם 250 גרם x ב RT וזורקים. Resuspend בתאים FACS מראש ומחוממת-buffer (1 x PBS, 2.5% שור אלבומין [BSA], 5 מ מ EDTA pH 8.0, 10 מיקרומטר Y-27632) על-פי ספירת התאים (5 x 106/mL). להוסיף מכתים FACS נוגדנים על פי נפח מאגר/FACS-ספירת התאים: CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/וסקולרית אנדותל (VE) – קדהרין – PE (100 µL/mL = 1/10), CD105-APC (µL 25/mL = 1/40), לערבב, תקופת דגירה של 7 דקות ב RT מוגן מפני אור; בעדינות קפיצי, תקופת דגירה של עוד 8 דקות (זמן דגירה סך של 15 דקות). להוסיף 2 מיליליטר FACS-buffer התליה תא שכותרתו באמצעות פיפטה סרולוגית. תגובת שיקוע צנטריפוגה במשך 4 דקות עם 250 גרם x ב RT וזורקים. לשטוף פעמיים על-ידי הוספת 2 מ”ל FACS-מאגר, ואת ההתנהגות של צנטריפוגה עוקבות עבור 4 דקות ב 250 g x ב- RT ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend תאים ב- 500 µL של טרום ומחוממת EBM-2-MV-עט/דלקת/ampho ותאי העברת מכשיר FACS-מיון. תאי אנדותל ימותו במהירות במהלך תהליך המיון אם מכשיר FACS הוא מקורר. לכן, לבצע מיון של תאי אנדותל-RT ולהעביר מיד את התאים שנאספו החממה 37 ° C לאחר מכן.הערה: מכשיר FACS הוא בדרך כלל תקיימו! מיון/לאסוף תאים טריפל-חיובית ישירות לתוך תבשיל התרבות התא (למשל, ובכן 24 צלחת מראש מצופה בין לילה עם 1.5% ג’לטין-PBS) מלא 0.5 מיליליטר בינוני טריים ומחוממת מראש (EBM-2-MV-עט/דלקת/ampho).הערה: בדוק תא הבולם לאחר המיון באמצעות מיקרוסקופ. אם התאים אשכול ביחד, לנסות לקבל אפילו תא הפצה בצלחת התרבות התא על-ידי ערבוב אותם לאט או הוספת בינוני. לטפח תאים עד 90-100% confluency עם 48 שעות במרווחי זמן של התחדשות בינוני ולהרחיב את התאים לגודל המנה התרבות הרצויה (צלחת 24-ובכן → 12 טוב-plate ← 3.5 ס”מ מאכל ← T-25 ← T-75). 4. הקציר ואפיון של תאי אנדותל טהור קציר תאים על 90-100% confluency, לאפיין אותם על ידי שיטה המתאימה (למשל, FACS, cytochemistry, תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) או7,מבחני תפקוד תאי אנדותל8). לנתח תאים מבודדים עם בכל שיטה אפיון נבחר.

Representative Results

בידודו של NEC וה -טק מ CRC האנושית על ידי דיסוציאציה בשילוב רקמה מכנית/enzymatical, ואחריו עוקבים CD31/CD105/VE-קדהרין-מונע FACS-מיון מתואר כאן (איור 1א’). פרוטוקול זה מייצג את פרוטוקול משופרת עם חלון זמן מופחת עד הקציר הראשון של תאי אנדותל טהור, קיימא לעומת פרוטוקול מבוסס במקינטוש הקודם7. NEC וה -טק הם בודדו אותנו מהמתרחש CRC האנושי באמצעות השלבים הבאים: (1) דור של השעיה תא בודד על-ידי בשילוב רקמה מכנית, אנזימטי דיסוציאציה וצמיחה של תאים אלה ל 80-90% confluency (איור 1), (2) לשלש תיוג של EC על ידי נוגדנים מצמידים fluorochrome CD31/CD105/VE-קדהרין ומיון (3) FACS-התאים טריפל-חיוביות בהתאמה (איור 2א). ראוי לציין, שלב קריטי להצלחת ההליך בידוד ואת הכדאיות של התאים היא במהירות נושא הדגימה ניתוח הפרוצדורה בידוד (דור של תא בודד השעיה < שעה לאחר כריתה). באמצעות FACS-מיון, ממוצע של 12,500 טק (n = 12), 17,800 NEC (n = 12, איור 2B, שמאלה) המייצג בממוצע 3.6 ו- 5.6% מהאוכלוסייה בתא סכום (איור 2B, נכון) יכולה להיות מבודדים. כתוצאה מכך, תאי הורחבו עד T-75 (הנקרא מעבר 1) וניתוח שנקטפו או מעובד נוסף. ראוי לציין, באמצעות פרוטוקול מבוסס במקינטוש הקודם, הושגה הצלחה בידוד הממוצע של 49.6% (n = 58 אקדח טהור של n = חולים 1178) עם הנציבות האירופית טהור תרבויות הזמינים בממוצע 6 שבועות לאחר הניתוח. באמצעות פרוטוקול מבוסס FACS חדשה שתואר כאן, התרבויות EC טהור הראשונה התקבלו בממוצע כשלושה שבועות לאחר הניתוח עם שיעור הצלחה בידוד 62.1% (n = 41 תרבויות EC טהור המתקבל n = 66 יחיד תאים המתלים נתון FACS-מיון). לכן, גידול של הקצב בידוד ב- 12.5% הושג במקביל עם ירידה של הזמן טיפוח 6 3 שבועות. הפחתה זו של הזמן טיפוח הוביל תא משופרת הכדאיות והאריך תוחלת החיים בליווי פחות חשיפה אינדוקציה של חפצי אמנות תלויית תרבות פוטנציאלי של התרבויות הוקמה. אפיון של EC טוהר נערך לראשונה על ידי CD31-cytochemistry (איור 3א). אם התרבויות היו ללא תאים CD31-שלילי (איור 3א, TEC ו- NEC), הם היו נתונים מפורטים יותר תא הקלדה על ידי שעתוק במהופך כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (RT-qPCR) (איור 3ב). סוג התא תחל ספציפי EC (CD31, CD105, VE-קדהרין ו Willebrand פון גורם [vWF]), לויקוציטים (CD45), תאים אפיתל (cytokeratin [CK]-20) של תאי שריר חלק/fibroblasts (desmin) שימשו (איור 3ב). שימוש תא זה מבוסס על qPCR הקלדה, זיהום פוטנציאליים של התרבויות EC על ידי תאים אחרים בטווח של 0.1 – 2%, בהתאם לסוג התא, יכול להיות שזוהו8. ראוי לציין, אנו קודם לכן דיווח לאובדן מועדף של vWF ביטוי חלבון בתרבויות טק בהשוואה שלהם תרבויות המתאימים NEC7. ממצאים אלה יכולים להיות מאושרות עם פרוטוקול בידוד שהוקם (איור 3C, כלומר Ct אובדן NEC-TEC = 0.687, p = 0.173, מזווגים t-test). תרבויות בהצלחה עובר בקרת איכות אלה היו נבדק mycoplasma זיהום, שלאחר מכן היה לניסויים נוספים. איור 1 : תאי אנדותל טהור ניתן לבודד מן המעי הגס האנושי נורמלי CRC על-ידי מיון FACS. (א) תרשים זרימה של צעדים חיוניים EC בתהליך בידוד. (צהוב), אחרים שאינם tumorous חלקים, או רקמת נמק שעלולים חלקים (חום) הוצאו מן הדגימה ניתוח (החלונית הימנית והאמצעית), הגידול היה התפוררה לקוביות של 2-3 מ מ אורך צד לפני הרקמה דיסוציאציה (רקמת השומן (B) לוח נכון). (ג) התא הבודד ההשעיה לאחזר לאחר רקמת דיסוציאציה (החלונית הימנית), נדגרה במשך 24 שעות ביממה במנות התרבות תאים. לאחר מכן, תאים שאינם מחסידי הוסרו על ידי שטיפה עדינים באמצעות PBS (לוח האמצעי), התאים היו מבוגרים ל 80-90% confluency לפני מיון FACS (לוח נכון). תמונות של הלוח התחתון (ג) נרכשו על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : ממוצע של 3.6-5.6% של התליה תא בודד מבודדים מחולים CRC האנושי והיו ממוין לפי FACS טריפל-חיוביות לכלכלת NEC (A) וטק היו באמצעות תיוג משולש של התאים עם נוגדנים anti-CD31, – CD105 ו- VE-קדהרין ממוין FACS. (B) א ממוצע של 12,500 אקדח (n = 12) ו- 17,800 NECs (n = 12) ניתן לבודד המעי הגס האנושי הרגיל או CRC באמצעות FACS-מיון (CD31, CD105 ו- VE-קדהרין-חיוביות תאים, עזב את החלונית), המייצג בממוצע 3.6 ו- 5.6% (לוח הנכון) של התא הכולל אוכלוסיית המועסקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : NEC וה -טק מ CRC האנושי אקספרס סמני תא אנדותל טיפוסי. תאי אנדותל נורמליים של המעי הגס (NEC, n = 10) גידול תאי אנדותל (טק, n = 10) מ CRC האנושי הם CD31 (סמן EC)-, CD105 (סמן EC)-, VE-קדהרין (סמן EC)-, vWF (סמן EC) – חיובי, CK20 (סמן תא CRC)-, desmin (סמן פיברובלסט/SMC)-, CD45 ( ליקוציט סמן)-שלילי כפי שנקבע על ידי (א) CD31-immunocytochemistry (תאים חיובי = אדום) ו- (B) RT-qPCR (נקודות הנתונים מתחת לקו מקווקו הן דוגמאות זוהה להיות שליליים). (ג) vWF ביטוי כפי שנקבע על ידי RT-qPCR עבור טק/NEC המתאימים, דגימות דעתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בעיקר, בשלוש שיטות שונות יש כבר מועסקים עד כה כדי לבודד טהורה ובת -קיימא NECs, אקדח של רקמות מוצק, כלומר העשרה (1) immunomagnetic, microdissection (2) לייזר ומיון (3) FACS-של השבר EC. רוב הפרסומים, העשרה immunomagnetic של התאים לאחר דור של השעיה תא בודד על-ידי התפוררות מכני היה בשימוש11,12,13. לדוגמה, immunomagnetic טיהור של האדם עורי microvascular EC (HDMEC) על-ידי בחירת שמלות E נוגדנים לאחר הגידול נקרוזה מקדם (TNF)-טיפול α. אל תדאג neonatal13 דווחה על בידודו של EC האנושי של glioma על ידי רקמת לעכל, מעבר percoll, ומבחר באמצעות אנטי-CD31/CD105 ו- VE-קדהרין-נוגדנים12, או באמצעות נוגדנים anti-CD105 מן האדם השד קרצינומה של11. פרוטוקולים של המועסקים microdissection לייזר או מיון-FACS דווחו בתדירות נמוכה יותר. לייזר microdissection נעשה שימוש, לדוגמה, כדי לזהות פוטנציאל פאן-הגידול סמנים תא אנדותל (TEMs) ב- EC נגזר האנושי קרצינומה של המעי הגס באמצעות ניתוח של התאים מיד לאחר ניתוח9. מיון-FACS באמצעות אנטי-CD31-נוגדנים בהצלחה הודגם על הבידוד של השבר EC מ עובריים מובחן האדם גזע תאים14.

גישות אלה יש שונות יתרונות וחסרונות צריך להיחשב. יתרונות הגישה מבוססת-immunomagnetic הם כי אין ציוד משוכלל נדרש, הבחירה יכול להתבצע בכל עת, ו העשרת התא הוא מהיר (כ- 15 דקות) לעומת FACS-מיון (כ ג 1). חוסר של מטריקס לתקופה ארוכה יותר של זמן עלול לגרום מוות תאים של הנציבות האירופית על-ידי anoikis. לפיכך, תוספת של מעכבי קינאז רו Y-27632 אל המאגר FACS הועסק כדי למנוע תא anoikis15.

החסרונות של העשרה immunomagnetic הן כי מספר סיבובים של הבחירה נדרשים על מנת להשיג הטוהר מעל 99%. יתר על כן, הטיפוח סלולריים בין enrichments נדרש עבור שחזור התא, אשר מגביר את הגיל של תרבויות המשנה הנוצרות על-ידי תרבות חפצי אמנות. לייזר microdissection היתרון שניתן תאים השתמשה מיד אשר מפחית את חפצי תרבות-induced אך כולל הסיכון של זיהום על ידי תאים לרקמות סמוכים אזורים10. יתר על כן, microdissection לא נוסדה בשנת בכל מעבדה. החסרונות של הגישה FACS-מיון מבוססי כוללים, הדומה לייזר microdissection, כי הציוד הוא משוכלל, עלות עתירי. בהתאם לכך, הציוד הזה לא יכול להיות נגיש בכל עת. בסביבה קלינית, איפה הזמינות של הרקמה עניין אי אפשר בדיוק לתכנן, זה עשוי להוסיף חיסרון נוסף.

עם זאת, היתרונות הגדולים של המיון FACS הם כי ניתן לסמן את השבר EC באמצעות נוגדנים מרובים במקביל. לכן, אסטרטגיה המגביל מחמירים יכול להיות מועסק אשר יבטיחו טוהר גבוהה. בהתבסס על ניסיון, אין מיון מחדש של השבר EC היה נדרש, בניגוד פרוטוקול מבוסס במקינטוש הקודם שבו מספר סיבובים של הבחירה היו. חייבים להיות מועסקים. זה הוביל זמן טיפוח מופחתת באופן משמעותי עד טוהר של שישה שבועות (מקינטוש הגישה) עד שלושה שבועות הגישה FACS, וכתוצאה מכך הכדאיות תא משופרים המאפשרים חלון זמן ממושך של ניתוח. לבסוף, באמצעות אסטרטגיה FACS-מיון מבוססי, שיפור של שיעור ההצלחה הכוללת בידוד יכולה להיות מושגת (עלייה של 12.5%). לסיכום, המיון FACS המבוסס על אסטרטגיה נוגדנים 3 המעסיקים במקביל אחרי רקמות תקציר מאת העיכול בשילוב רקמה מכנית, אנזימטי יתרונות רבים אשר נוסדה פרוטוקול זה כמו שיטת הבחירה עבור בידודו של אקדח NECs מן האנושי קרצינומה של המעי הגס והמעי הגס.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים Flierl כריסטיאן Katja Petter, כריסטינה Schnürer (כל חלוקה של מולקולרית ו ניתוח ניסיוני), Uwe Appelt, מייקל Mroz (מיון ליבה יחידה FACS), סיימון Völkl (ליבה יחידה FACS-Immunomonitoring) לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים EN/MS של המרכז הבינתחומי עבור קליני מחקר (IZKF) של אוניברסיטת רפואי מרכז ארלאנגן, קרן מחקר גרמני (DFG: עבור 2438, SP2) ולא את לוץ-Stiftung, על ידי מענק של רוברט-Pfleger-Stiftung אל VSS, כמו גם על ידי מענקים ל MS מטעם קרן מחקר גרמני [DFG: KFO257 (תת הפרויקט 4), SFB 796 (תת הפרויקט B9)].

Materials

HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  4. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  5. Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
  6. Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
  7. Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
  8. Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
  9. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  10. Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
  11. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
  12. Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
  13. Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
  14. Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).

Tags

Endothelial CellsColorectal CarcinomaTumor BiologyAngiogenesisCell Isolation ProtocolHBSS BufferDMEM MediumCell StrainerCentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image