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Cancer Research

Isolierung der menschlichen Endothelzellen aus normalen Colon und kolorektalen Karzinom - eine verbesserte Protokoll

Published: April 04, 2018
doi:
10.3791/57400
, , , , , , , , ,
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg

Summary

Tumor Endothelzellen sind wichtige Determinanten für die Tumor-Mikroumgebung und den Verlauf der Krankheit. Hier wird ein Protokoll für die Isolation der reinen und tragfähige endothelial Zellen aus menschlichen kolorektalen Karzinom und normalen Doppelpunkt in der Arzneimittelforschung Test- und Pathogenese verwendet werden beschrieben.

Abstract

Primäre Zellen aus menschlichen Karzinomen isoliert sind wertvolle Tools, pathogene Mechanismen, die einen Beitrag zur Entwicklung der Krankheit und das Fortschreiten zu identifizieren. Insbesondere Endothelzellen (EG) bilden die innere Oberfläche der Gefäße, direkt Sauerstoffzufuhr, Nährstoffversorgung und Ableitung von Abfallstoffen zu und von Tumoren beteiligt und engagieren uns so prominent in der Verfassung des Tumors Mikroumgebung (TME). Tumor Endothelzellen (TECs) können als zelluläre Biosensoren für die intratumorale Mikroumgebung festgelegten Kommunikation zwischen Tumor und Stromazellen Zellen verwendet werden. TECs dienen auch als Ziele der Therapie. Entsprechend, ermöglichen diese Zellen in Kultur Studien über Mechanismen der Antwort oder Widerstand gegen die Anti-angiogene Behandlung. Vor kurzem wurde festgestellt, dass TECs aus menschlichen kolorektalen Karzinoms (CRC) isoliert Ausstellung Speicher-ähnliche Effekte anhand der spezifischen TME sie abgeleitet wurden. Darüber hinaus tragen diese TECs aktiv zur Schaffung einer spezifischen TME durch die Sekretion von verschiedenen Faktoren ab. Z. B. absondern TECs in eine prognostisch günstige Th1-TME Anti-angiogenen Tumor-suppressive Faktor sezerniert Protein, sauer und reich an Cystein-Like 1 (SPARCL1). SPARCL1 Schiff Homöostase reguliert und hemmt die Tumor-Zell-Proliferation und Migration. Kulturen der reinen, lebensfähigen TECs isoliert von soliden menschlichen Tumoren sind daher ein wertvolles Werkzeug für funktionelle Studien über die Rolle des Gefäßsystems in Tumorgenese. Hier wird ein neues aktuelles Protokoll für die Isolierung von primären EG aus dem normalen Dickdarm sowie CRC beschrieben. Die Technik basiert auf mechanische und enzymatische Gewebe Verdauung, Immunolabeling und Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS)-Sortierung der Dreifach-positiven Zellen (CD31, VE-Cadherin, CD105). Mit diesem Protokoll tragfähige TEC oder normalen endothelialen Zellkulturen (NEC) isoliert werden konnte aus dem Dickdarm Gewebe mit einer Erfolgsquote von 62,12 % bei FACS-Sortierung (41 EG Reinkulturen von 66 Gewebeproben). Dementsprechend bietet dieses Protokoll einen robusten Ansatz um menschliche EG-Kulturen aus normalen Kolon und CRC zu isolieren.

Introduction

Der Tumor Mikroumgebung (TME) ist definiert als eine enge Verzahnung von Tumorzellen mit dem Tumor-Stroma, die von Zellen wie Endothelzellen (EG), Perizyten, Fibroblasten, glatten Muskelzellen oder Immunzellen besteht. Die Kommunikation zwischen diesen zellulären Kompartimenten kann durch parakrine Faktoren (z. B. angiogene Wachstumsfaktoren, Zytokine), die extrazelluläre Matrix oder direkten Zell-Zell-Kontakt werden angetrieben. Die stromale Fach kann zu fördern oder entgegenzuwirken, Tumorentstehung oder Progression, je nach der spezifischen TME gegründet.

Die Fähigkeit eines Tumors, mit dem Gefäßsystem zu verbinden ist der Schlüssel auf die Progression und Metastasierung von der Krankheit. Das Schiff-System ermöglicht den Tumor überwiegend zum Zugriff auf die Lieferung von Sauerstoff und Nährstoffen sowie die Beseitigung der Abfallprodukte1,2,3. EG bilden die innere Oberfläche der Schiffe und sind daher wichtige Zellbestandteile, die aktiv an diesem Prozess zu beteiligen. Es ist bekannt, dass Tumor Endothelzellen (TEC) anders als ihre entsprechenden normalen Endothelzellen (NEC) durch viele Features wie gestörte Hierarchie der vaskulären Baum, Schiff Undichtigkeit sind oder Reifung reduziert, wie von einer reduzierten Anzahl von Perizyten/Wandbild-Zellen, die nur lose an die EG-4verbunden sind.

TECs sind daher wertvolle zellulären Werkzeuge, Karzinogenese zu studieren. TECs galten vor allem Tumor Wachstum und Fortschritt3zu fördern. Dadurch können TECs einsetzbar als Biosensoren, die es die Überwachung ermöglichen und Identifizierung von pathogenen Prozessen, die zu initiieren, zu fördern oder Tumorgenese entgegenzuwirken. Darüber hinaus sind sie therapeutische Targets in der Klinik5. Infolgedessen können isolierte TECs und entsprechende NEC auch als Werkzeuge verwendet werden, um Mechanismen der Antwort oder Widerstand gegen die Anti-angiogene Behandlung zu verstehen.

In der Vergangenheit entwickelt ein Protokoll, um diese Zellen6,7 isolieren und festgestellt, dass TECs unterscheiden sich nicht nur von NEC, aber auch voneinander abweichen, abhängig von der TME sie aus8abgeleitet wurden. Durch diesen Ansatz zeigte sich, dass TECs in bestimmten TMEs Tumorwachstum und Progression aktiv entgegenwirken können durch Sekretion von Anti-angiogenen Tumor-suppressive Proteine wie SPARCL1. Darauf hingewiesen, dass TECs zur Errichtung einer prognostisch günstige TME in menschlichen kolorektalen Karzinoms (CRC)8aktiv sind.

Frühere Studien haben versucht, menschliche TECs von soliden Tumoren zu isolieren. Ein wichtiges Ziel dieser Studien war, z. B. die Identifizierung von neuen Tumor Endothelzellen Marker (TEMs)9. Eine Strategie für den sofortigen Einsatz von TECs nach Laser-Mikrodissektion angewendet wurde, um Veränderung zu vermeiden oder Verlust des TEC-Phänotyps in Kultur. Follow-up Studien identifiziert jedoch kontaminierenden Einwohner Wandbild Zellen als ein gravierender Nachteil dieses Ansatzes10. Unser Labor war der erste, ein Protokoll zu entwickeln, die die Isolation der reinen, lebensfähigen TECs von menschlichen CRC Patienten6,7zulässig. Ein Ansatz mit mehreren magnetischen Zelle (MACS) Auswahlrunden der TECs, die hohen Reinheit der isolierten EG Kulturen sichergestellt wurde gewählt. Dieser Ansatz allerdings einen relativ langen Anbau Zeitraum (6 Wochen im Durchschnitt), der ein Risiko von Kultur-induzierte Artefakten erhöhtes. Daher wurde das Ziel im nächsten Schritt Anbau zwischen Chirurgie und Ernte die erste Reinkultur verkürzen. Um dieses Ziel zu erreichen, eine verbesserte Protokoll mit einer kombinierten mechanische und enzymatische-basierte Gewebe Dissoziation des ursprünglichen Tumors, gefolgt von Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS)-Sortierung der Dreifach-Label EG entwickelt wurde. Dies reduziert, Isolierung Zeit durchschnittlich bis zu drei Wochen, wodurch TEC und NEC Reinkulturen mit erhöhter Tragfähigkeit für funktionelle Studien. Isolierung von lebensfähigen TEC und NEC Reinkulturen von menschlichem Gewebe mit hohen Erfolgsquoten kann neue Wege für die Patienten-spezifischen Drogentests bei der Entwicklung von individualisierten Therapie Therapien öffnen. Die Isolierung-Ansatz wird in den folgenden Abschnitten beschrieben.

Protocol

Die Isolierung-Prozess wurde von der lokalen Ethikkommission der Universität Medical Center Erlangen (#159_15 B, TuMiC-Studie) genehmigt. Patienten Einschlusskriterien waren wie folgt: CRC, UICC Stadium I-IV, keine Geschichte der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und keine neoadjuvante Therapie. 1. Chirurgie und Vorbereitung des Gewebes für die einzelne Zelle Isolierung Probe durch eine Operation von einem CRC-Patienten erhalten (Karzinom-Gewebe > 0,5 g, zentrale nicht nekrotische Tumor; Doppelpunkt Normalgewebe > 10 cm Tumor-Website). Die erhaltenen Gewebe Stücke sind meist 1 g für den normalen Dickdarm. Wenn Stücke > 1 g sind erhalten, teilen Sie sie in mehrere 1 g Stücke mit einem frischen Skalpell für Weiterverarbeitung Gewebe.Hinweis: Ist der Tumor-Gewebe-Stück unter 0,5 g von Anfang, schlägt fehl die Isolation in der Regel. Sammeln frische unfixierten Gewebe Stücke mit sterilen Pinzette in 40 mL Eis kalt Hanks Salzlösung (HBSS ausgewogen) ergänzt mit Penicillin/Streptomycin/Amphothericin B (1 % HBSS-Pen/Strep/Ampho) in 50 mL Zentrifuge Röhren und übertragen Sie sie schnell auf die Labor.Hinweis: Colon Gewebe ist mit Bakterien/Pilze von Anfang häufig stark kontaminiert. Während des gesamten Verfahrens der Isolation muss Pen/Strep/Ampho alle Lösungen hinzugefügt werden um kontaminierenden Organismen zu beseitigen. Waschen Sie jedes Gewebe Stück mindestens 4 Mal mit 40 mL Eis kalt HBSS-Pen/Strep/Ampho (siehe Punkt 1.3) in 50 mL Zentrifuge Röhren durch Übertragung von Gewebe Stücke nacheinander von einem Zentrifugenröhrchen auf das nächste Rohr mit sterilen Pinzette. Sauberen Pinzette nach jedem Schritt mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie separate Zange für das Karzinom und normalen Doppelpunkt Gewebe Stücke. Wiegen Sie alle Gewebe Stücke.Hinweis: Legen Sie Gewebe Stücke nicht direkt auf eine Waage zum wiegen. Nach dem Waschen, wiegen Sie die letzten Zentrifugenröhrchen mit Gewebe vor und nach der Eingabe der Gewebe-Stücke. Berechnen Sie das Gewicht der einzelnen Gewebe Stücke durch Subtraktion. 2. Generation des einzigen Zellsuspension Hinweis: Es empfiehlt sich, das Gewebe mit Feuchtigkeit zu allen Zeiten zu halten. Wenn es vorhanden ist, entfernen Sie beigefügten Fett, andere nicht-tumoröse Gewebe oder potenziell nekrotischen Gewebeteile aus der Chirurgie Probe durch die Übertragung der Gewebe-Stücke in einer sterilen Zelle Kultur Petrischale mit sterilen Pinzette. Halten Sie die Gewebe-Stücke mit Feuchtigkeit bei allen Zeiten durch Zugabe von 3-5 mL HBSS-Pen/Strep/Ampho. Schneiden Sie die Gewebe-Stücke mit einem frischen sterilen Skalpell (Abbildung 1). Für den Fall, dass Gewebe Identifikation unklar ist, wenden Sie sich an ein Pathologe. Verbleibende Gewebe in kleine Stücke hacken (ca. 2 × 2 × 2 mm3) mit einem frischen Skalpell mit einer gebogenen Klinge. Gewebe-Stücke mit der sterilen Pinzette in Gewebe Dissoziation Röhren (z. B. GentleMACS C Rohre) vorausgefüllt mit vorgewärmten (37 ° C) Zellkulturmedium (Dulbecco´s modifiziert Adler Mittel [DMEM] basal Mittel) nach Angaben des Herstellers zu übertragen Anweisungen.Hinweis: Versuchen Sie, das Skalpell wie ein rockig-Tool verwenden. Drücken Sie die Zellen nicht um Gewebeschäden zu vermeiden. Digest/distanzieren Gewebe Stücke mit einem Gewebe Dissociator (wie GentleMACS Octo Dissociator) in Kombination mit dem Tumor-Dissoziation-Kit für menschliches Gewebe mit den Anweisungen des Programms “37C_h_TDK_1” nach den letztgültigen. Zentrifugieren Sie Dissoziation Röhren für 1 min bei 300 X g bei Raumtemperatur (RT). 10 mL vorgewärmten (37 ° c) DMEM mit 0,5 % fötalen Rinderserum (FBS) (DMEM-Low) für jedes Rohr mit einer serologischen Pipette ergänzt und Filtern Sie die Zellsuspension mit einer Zelle Sieb (100 µm Porengröße) auf ein 50 mL Zentrifugenröhrchen durch Pipettieren der Zelle Federung auf den Filter. Fügen Sie 10 mL DMEM-Low wieder jedes MACS-Rohr mit einer serologischen Pipette hinzu und übertragen Sie verbleibende Zellen in der Zelle Sieb oben auf 50 mL Zentrifugenröhrchen zu. Waschen Sie die Zelle Sieb einmal mit einem zusätzlichen 10 mL DMEM-Low Medium mit einer serologischen Pipette. Zentrifugieren der Zellsuspension für 7 min bei 300 X g bei RT und überstand verwerfen. Zellen in 5 mL vorgewärmten endotheliale basal Medium (EBM)-2 aufzuwirbeln-mikrovaskuläre (MV) Medium (Lonza) mit Stift/Strep/Ampho in der gleichen 50 mL Zentrifugenröhrchen ergänzt. Platte Zellsuspension in einem t-25 Zelle Kultur Kolben vorbeschichtet über Nacht mit 1,5 % Gelatine-Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C mit 5 % CO2. Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2, waschen Sie die Zellen zwei mal vorsichtig mit ca. 5 mL PBS und fügen Sie 5 mL frisches Medium hinzu. Pflegen Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 bis 80-90 % Konfluenz (in der Regel 5-7 Tage) mit 48 h-Intervallen von mittleren Erneuerung. (3) FACS-Sortierung der Endothelzellen Hinweis: Versuchen Sie nicht zu verlieren Zellen an jedem Punkt, z. B. durch die Begrenzung Färbeverfahren zur Inkubation der Zellen in einem einzigen Reagenz-Rohr. Lösen Sie Zellen mit 1 mL Accutase (ca. 10 min) zu, und 4 mL vorgewärmten (37 ° C) EBM-2-MV Medium. Zellzahl, die mit einer automatisierten Zelle Zähleinrichtung (Bereich 10-25 µm) zu bestimmen. Zentrifugieren Sie Zellsuspension für 4 min mit 250 X g bei RT und verwerfen Sie überstand. Aufschwemmen Zellen in vorgewärmten FACS-Puffer (1 X PBS, 2,5 % Rinderserumalbumin [BSA], 5 mM EDTA pH 8.0, 10 µM Y-27632) nach Zellzahl (5 x 106/mL). FACS-Färbung Antikörper nach Graf/FACS-Puffer Zellvolumen hinzufügen: CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/vaskulären endothelialen (VE) – Cadherin – PE (100 µL/mL = 1/10), CD105-APC (25 µL/mL = 1/40), mischen und inkubieren 7 min bei RT lichtgeschützt; sanft streichen und weitere 8 Minuten (für eine gesamte Inkubationszeit von 15 min) inkubieren. Die beschrifteten Zellsuspension mit einer serologischen Pipette fügen Sie 2 mL FACS-Puffer hinzu. Zentrifuge für 4 min mit 250 X g bei RT und überstand verwerfen. Waschen Sie zweimal durch Zugabe von 2 mL FACS-Puffer, und führen Sie eine anschließende Zentrifugation für 4 min bei 250 X g bei RT und verwerfen Sie überstand. Aufschwemmen Sie Zellen in 500 µL vorgewärmten EBM-2-MV-Pen/Strep/Ampho und Transfer zum Sortieren von FACS Instrument. Endothelzellen werden schnell während der Sortiervorgang sterben, wenn das FACS-Instrument gekühlt wird. Daher sofort zu übertragen Sie, die gesammelten Zellen in den Inkubator 37 ° C danach und Sortierung von Endothelzellen bei RT durchführen.Hinweis: Das FACS-Instrument ist in der Regel unsteril! Art/Collect Triple-positiven Zellen direkt in eine Zelle Kulturschale (z. B. 24-Well-Platte über Nacht vorbeschichtet mit 1,5 % Gelatine-PBS) gefüllt mit 0,5 mL vorgewärmten frisches Medium (EBM-2-MV-Pen/Strep/Ampho).Hinweis: Überprüfen Sie Zellsuspension nach Sortierung unter Verwendung eines Mikroskops. Wenn die Zellen zusammen cluster, versuchen Sie, eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in der Kulturschale Zelle zu erhalten, indem sie langsam mischen oder Medium. Zellen bis zu 90-100 % Konfluenz mit 48 h-Intervallen von mittleren Erneuerung zu kultivieren und die Zellen auf die gewünschte Kultur Schale Größe zu erweitern (24-Well-Platte → 12 Well-Platte → 3,5 cm Schüssel → t-25 → T-75). 4. Ernte und Charakterisierung von reinen Endothelzellen Ernten Sie Zellen bei 90-100 % Konfluenz zu und kennzeichnen sie durch ein geeignetes Verfahren (z. B. FACS, Cytochemistry, quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) oder endothelial Zelle Funktion Assays7,8). Analysieren Sie isolierte Zellen mit welcher Charakterisierung Methode gewählt wird.

Representative Results

Die Isolierung von NEC und TEC von menschlichen CRC durch eine kombinierte Maschinen-/enzymatischen Gewebe Dissoziation, gefolgt von weiteren CD31/CD105/VE-Cadherin-orientierte FACS-Sortierung wird beschrieben (Abb. 1A) hier. Dieses Protokoll stellt eine verbesserte Protokoll mit einem reduzierten Zeitfenster bis zur ersten Ernte der reinen, lebensfähigen endothelial Zellen im Vergleich zu den vorherigen MACS-basiertes Protokoll7. NEC und TEC wurden isoliert von menschlichen CRC mit den folgenden Schritten: (1) Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension durch kombinierten mechanische und enzymatische Gewebe Dissoziation und Wachstum dieser Zellen zu 80-90 % Konfluenz (Abbildung 1), (2) dreifach-Kennzeichnung der EG CD31/CD105/VE-Cadherin Fluorochrom-gekoppelten Antikörper, und (3) FACS-Sortieren der jeweiligen Triple-positiven Zellen (Abb. 2A). Der Hinweis, ein entscheidender Schritt für den Erfolg des Verfahrens Isolierung und Lebensfähigkeit der Zellen zu schnell ist vorbehaltlich die Chirurgie Probe Isolierung Verfahren (Erzeugung von einzelnen Zellsuspension < 1 Stunde nach der Resektion). Mit FACS-Sortierung, einen Mittelwert von 12.500 TEC (n = 12) und 17.800 NEC (n = 12, Abbildung 2B, links) aus einem Durchschnitt von 3,6 und 5,6 % der gesamten Zellpopulation (Abbildung 2B, rechts) isoliert werden konnte. Anschließend wurden die Zellen bis zu T-75 (Durchgang 1 bezeichnet) und entweder geerntet oder weiterverarbeitet für Analyse erweitert. Note, mit der vorherigen MACS-basiertes Protokoll, erreichte ein durchschnittliche Isolierung Erfolg von 49,6 % (n = 58 reine TECs aus n = 117 Patienten8) mit reinen EG Kulturen zur Verfügung im Durchschnitt 6 Wochen nach der Operation. Mit der neuen FACS-basiertes Protokoll beschrieben hier, die erste EG-Reinkulturen erhielten durchschnittlich 3 Wochen nach der Operation mit einer Isolierung Erfolgsquote von 62,1 % (n = 41 Reinkulturen EG entnommen n = 66 einzelne Zellen Suspensionen FACS-Sortierung ausgesetzt). Daher wurde ein Anstieg um 12,5 % der Isolierung parallel mit einer Abnahme der Anbau Zeit von 6 bis 3 Wochen erreicht. Diese Verkürzung der Anbau führte zu verbesserte Zellviabilität und verlängerte Lebensdauer durch weniger Belastung durch die Induktion von potenziellen Kultur-abhängigen Artefakten der etablierten Kulturen begleitet. Charakterisierung der EG Reinheit führte zuerst CD31-Cytochemistry(Abbildung 3). Wenn die Kulturen CD31-negativen Zellen (Abb. 3A, TEC und NEC) waren, wurden sie eine detailliertere Zelle eingeben durch reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) (Abbildung 3B) unterzogen. Zelltyp spezifische Primer für EG (CD31, CD105, VE-Cadherin und von-Willebrand-Faktor [VVS]), Leukozyten (CD45), Epithelzellen (Cytokeratin [CK]-20) und glatten Muskel Zellen/Fibroblasten (Desmin) verwendet wurden (Abbildung 3B). Mit dieser qPCR-basierte Zelle eingeben, eine mögliche Kontamination der EG Kulturen von anderen Zellen im Bereich von 0,1 – 2 %, je nach Zelltyp, lassen sich erkannte8. Vor allem berichteten wir bereits einen bevorzugten Verlust der vWF-Protein-Expression in TEC Kulturen im Vergleich zu dem entsprechenden NEC Kulturen7. Diese Ergebnisse konnten mit dem neu gegründeten Isolierung Protokoll bestätigt werden (Abbildung 3C, Ct Verlust NEC-TEC bedeuten = 0,687, p = 0.173, gepaart t-Test). Erfolgreichem Bestehen dieser Qualitätskontrollen Kulturen wurden für Mykoplasmen-Infektion getestet und anschließend für weitere Experimente verwendet. Abbildung 1 : Reine Endothelzellen können von normalen menschlichen Dickdarm und CRC von FACS-Sortierung isoliert werden. (A) die wesentlichen Schritte des Prozesses EG Isolierung Flussdiagramm. (B) Fettgewebe (gelb), andere nicht-tumoröse Teile oder potenziell nekrotischen Gewebeteile (braun) wurden von der Chirurgie Probe (linken und mittleren Panel) entfernt und der Tumor war in Würfel von ca. 2-3 mm Seitenlänge vor Gewebe Dissoziation (aufgelöst Rechte Abbildung). (C) die einzelne Zelle Aussetzung abgerufen nach Gewebe Dissoziation (linken) für 24 h in Zelle Kultur Gerichte inkubiert wurde. Anschließend nicht anhaftende Zellen wurden durch sanftes waschen mit PBS (mittlere Panel) entfernt und die Zellen wurden gezüchtet um 80-90 % Konfluenz vor FACS-Sortierung (rechte Abbildung). Bilder von der unteren Leiste (C) wurden von Phasenkontrastmikroskopie übernommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Durchschnittlich 3,6-5,6 % der Einzelzelle Suspension von menschlichen CRC-Patienten isoliert und sortiert nach FACS waren dreifach-positiven EC (A) NEC und TEC wurden mit einer dreifachen Kennzeichnung der Zellen mit Anti-CD31, CD105 und -VE-Cadherin Antikörper FACS sortiert. (B) ein Mittelwert von 12.500 TECs (n = 12) und 17.800 NEC (n = 12) können aus normalen menschlichen Dickdarm oder CRC mit FACS-Sortierung (CD31, CD105 und VE-Cadherin-positiven Zellen, Panel links), die im Durchschnitt 3,6 und 5,6 % (rechte Abbildung) der gesamten Zelle darstellt isoliert werden die Bevölkerung beschäftigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : NEC und TEC von menschlichen CRC express typische Endothelzellen Marker. Normale Doppelpunkt endotheliale Zellen (NEC, n = 10) und Tumor Endothelzellen (TEC, n = 10) von menschlichen CRC sind CD31 (EG Marker)-, CD105 (EG Marker)-, VE-Cadherin (EG Marker)-, vWF (EG Marker) – positive und CK20 (CRC Zellmarkierung)-, Desmin (Fibroblasten/SMC Marker)-, CD45 ( Leukozyten-Marker)-negative (A) CD31-Immunocytochemistry bestimmt (positive Zellen = rot) und (B) RT-qPCR (Datenpunkte unterhalb der gestrichelten Linie sind Proben negativ erkannt). (C) vWF Ausdruck von RT-qPCR für entsprechende TEC/NEC Proben aus den gleichen Patienten bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Vor allem, haben bisher drei verschiedene Methoden eingesetzt worden, um rein und tragfähige NEC und TECs von menschlichen festen Geweben, nämlich (1) Immunomagnetic Bereicherung, (2) Laser Mikrodissektion und (3) FACS-Sortierung der EG-Fraktion zu isolieren. In den meisten Publikationen war Immunomagnetic Anreicherung der Zellen nach der Generierung einer einzelnen Zelle Suspension durch mechanischen Zerfall verwendeten11,12,13. Zum Beispiel Immunomagnetic Reinigung des menschlichen dermalen mikrovaskuläre EG (HDMEC) durch E-Selektin Antikörper nach Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-α-Behandlung von Neugeborenen etwa13 berichtet von Gewebe für die Isolierung von menschlichen EG vom Gliom verdauen, Percoll Farbverlauf und mit Anti-CD31/CD105 und VE-Cadherin-Antikörpern12, Auswahl oder durch Anti-CD105 Antikörper aus menschlichen Brust Karzinom11. Protokolle, die Laser-Mikrodissektion oder FACS-Sortierung eingesetzt wurden weniger häufig berichtet. Laser-Mikrodissektion verwendet wurde, z. B. zur Identifizierung potenzieller Pan-Tumor Endothelzellen Marker (TEMs) im EG abgeleitet menschlichen kolorektalen Karzinoms mit Analyse der Zellen unmittelbar nach Dissektion9. FACS-Sortierung mit Anti-CD31-Antikörpern erfolgreich zeigte sich für die Isolierung von der EG-Bruch aus undifferenzierten humane embryonale Stammzellen-14.

Diese Ansätze haben unterschiedliche vor- und Nachteile, die berücksichtigt werden müssen. Die Vorteile für den Immunomagnetic-basierten Ansatz sind, dass keine aufwendige Ausrüstung erforderlich ist, die Auswahl jederzeit durchgeführt werden kann, und die Zelle Bereicherung ist schnell (ca. 15 min) im Vergleich zu FACS-Sortierung (ca. 1 h). Der Mangel an Matrix für einen längeren Zeitraum hinweg kann Zelltod der EG von Anoikis induzieren. Daher arbeitete Zugabe von Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 auf den Puffer, FACS, Zelle Anoikis15zu verhindern.

Die Nachteile der Immunomagnetic Bereicherung sind mehrfache Umläufe der Auswahl erforderlich ist, um über 99 % Reinheit zu erreichen. Darüber hinaus ist Zellkultivierung zwischen Bereicherungen für die Zelle Wiederherstellung, die das Alter der Kulturen unterstützen Kultur-induzierte Artefakte erforderlich. Laser-Mikrodissektion hat der Vorteil, dass Zellen können sofort eingesetzt, die Kultur-induzierte Artefakte reduziert aber beinhaltet das Risiko einer Kontamination von Zellen aus angrenzenden Gewebe Bereiche10. Darüber hinaus ist Mikrodissektion nicht in jedem Labor hergestellt. Die Nachteile des FACS-Sortierung-basierten Ansatzes sind, ähnlich wie laser-Mikrodissektion, ob die Ausrüstung aufwendig und kostenintensiv ist. Dementsprechend kann dieses Gerät nicht jederzeit zugänglich. In einer klinischen Einstellung, wo die Verfügbarkeit des Gewebes des Interesses nicht genau planbar, kann dies einen weiteren Nachteil hinzufügen.

Allerdings sind die großen Vorteile der FACS-Sortierung, dass der EG-Bruch durch mehrere Antikörper parallel beschriftet werden kann. So kann eine strenge gating Strategie eingesetzt werden, die gewährleisten eine hohe Reinheit. Basierend auf Erfahrung, bedurfte es nicht neu sortieren der EG-Fraktion, im Gegensatz zu den vorherigen MACS-basiertes Protokoll wo mehrfache Umläufe der Auswahl eingesetzt werden musste. Dies führte zu einer deutlich reduzierten Anbau Zeit bis Reinheit von sechs Wochen (MACS Ansatz) bis zu drei Wochen in der FACS-Ansatz, was zu einer verbesserten Zellviabilität ermöglicht eine längere Zeitfenster der Analyse. Schließlich mit Hilfe der FACS-Sortierung-basierte Strategie, eine Verbesserung der Isolierung Erfolgsquote könnte sein (Steigerung von 12,5 %) erreicht. Zusammenfassend basiert die FACS-Sortierung Strategie beschäftigt 3 Antikörper parallel nach Gewebe Digest von kombinierten mechanische und enzymatische Gewebe Verdauung hatte zahlreiche Vorteile, die dieses Protokoll als die Methode der Wahl für die Isolierung von TECs etabliert und NEC aus menschlichen kolorektalen Karzinom und Darmkrebs.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bedanken uns bei Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (Abteilung Molekulare und Experimentelle Chirurgie), Uwe Appelt, Michael Mroz (Core Unit FACS-Sortierung) und Simon Völkl (Core Unit FACS-Immunomonitoring) für die ausgezeichnete technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu EN/MS des interdisziplinären Zentrums für klinische Forschung (IZKF) von der University Medical Center Erlangen, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG: für 2438, SP2) und Lutz-Stiftung durch ein Stipendium der Robert-Pfleger-Stiftung VSS sowie durch Zuschüsse an MS von der Deutschen Forschungsgemeinschaft vergeben [DFG: KFO257 (Teilprojekt 4), SFB 796 (Teilprojekt B9)].

Materials

HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP
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References

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Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).
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