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Cancer Research

Isolement des cellules endothéliales humaines du côlon Normal et carcinome Colorectal - un protocole amélioré

Published: April 04, 2018
doi:
10.3791/57400
, , , , , , , , ,
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen,Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg

Summary

Cellules endothéliales tumorales sont des déterminants importants du microenvironnement tumoral et l’évolution de la maladie. Ici, un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales pures et viables de carcinome colorectal humain et côlon normal pour être utilisé dans la recherche de tests et la pathogenèse est décrite.

Abstract

Primaire les cellules isolées de carcinomes humaines sont des outils précieux pour identifier les mécanismes pathogènes qui contribuent à la progression et le développement de la maladie. En particulier, les cellules endothéliales (EC), qui constitue la surface intérieure des vaisseaux, participer à l’apport d’oxygène, de nutriments et élimination des déchets produits et de tumeurs directement et participent ainsi en bonne place dans la constitution de la tumeur microenvironnement (TME). Cellules endothéliales tumorales (TECs) peuvent servir de biocapteurs cellulaires du microenvironnement intratumorale établie par la communication entre la tumeur et les cellules du stroma. TECs servent aussi des objectifs de la thérapie. En conséquence, en culture ces cellules permettent des études sur les mécanismes de réponse ou de résistance au traitement anti-angiogénique. Récemment, il a été constaté que les TECs isolement de carcinome colorectal humain (CRC) pièce effets mémoire basés sur le TME spécifique qu’ils provenaient. En outre, ces TECs contribuent activement à la mise en place d’un TME spécifique par la sécrétion de facteurs différents. Par exemple, TECs dans un points favorable Th1-TME sécrètent la protéine anti-angiogénique de tumeur-suppressive facteur sécrété, acide et riche en cystéine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 régule l’homéostasie de navire et inhibe la migration et la prolifération des cellules tumorales. Cultures de TECs pures et viables isolées de tumeurs solides humaines sont donc un outil précieux pour des études fonctionnelles sur le rôle du système vasculaire dans la tumorigenèse. Ici, un nouveau protocole à jour pour l’isolement de ce primaire du côlon normal ainsi que le CRC est décrite. La technique est basée sur la digestion mécanique et enzymatique des tissus, immunomarquage et cellule à fluorescence activé (FACS) de tri-Tri des cellules positives à triple (CD31, VE-cadhérine, CD105). Avec ce protocole, TEC viable ou des cultures de cellules endothéliales normales (NEC) pouvaient être isolées des tissus du côlon avec un taux de réussite de 62.12 % lorsqu’ils sont soumis au tri des FACS (41 EC des cultures pures de 66 échantillons de tissu). Par conséquent, ce protocole prévoit une approche solide pour isoler les cultures humaines EC de normale du côlon et le CRC.

Introduction

Le microenvironnement tumoral (TME) est défini comme une interaction étroite des cellules tumorales avec le stroma tumoral, qui est composé de cellules comme les cellules endothéliales (EC), péricytes, fibroblastes, cellules musculaires lisses ou cellules immunitaires. La communication entre ces compartiments cellulaires peut être branchée par des facteurs paracrines (p. ex., les facteurs de croissance angiogéniques, cytokines), de la matrice extracellulaire ou contact direct cellule-cellule. Le compartiment stromal peut-être favoriser ou contrecarrer initiation tumorale ou progression, selon le TME spécifique mis en place.

La possibilité d’une tumeur de connecter avec le système de navire est essentielle à la progression et la métastase de la maladie. Le système de bateau permet la tumeur principalement accéder à la livraison de l’oxygène et de nutriments ainsi que l’élimination des déchets produits1,2,3. CE constituent la surface intérieure des vaisseaux et sont donc des éléments cellulaires importants qui participent activement à ce processus. Il est bien connu que les cellules endothéliales tumorales (TEC) sont différentes pour les cellules endothéliales normales correspondantes (NEC) de nombreuses fonctionnalités telles que hiérarchie perturbée de l’arbre vasculaire, perméabilité du navire, ou réduit la maturation comme en témoigne un nombre réduit de cellules de péricytes/peinture murale seulement lâchement attachés à l’EC4.

Par conséquent, TECs sont des outils cellulaires précieux pour l’étude de la cancérogenèse. TECs étaient considérés avant tout favoriser la tumeur de croissance et la progression3. Ainsi, TECs peuvent être utilisés comme biocapteurs permettant le suivi et l’identification des processus pathogènes initier, encourager ou contrecarrer la tumorigenèse. De plus, ils sont des cibles thérapeutiques dans la clinique5. Par conséquent, TECs isolés et NECs correspondants peuvent également servir outils pour comprendre les mécanismes de réponse ou de résistance au traitement anti-angiogénique.

Dans le passé, nous avons mis au point un protocole pour isoler ces cellules6,7 et nous avons identifié que TEC n’est pas seulement différents de NECs, mais aussi diffère entre eux selon la TME qu’ils provenaient de8. Grâce à cette approche, il a été démontré que les TECs dans certains eut peuvent contrecarrer activement la croissance tumorale et progression par la sécrétion de protéines tumorales-suppressive anti-angiogéniques tels que SPARCL1. Ceci indique que les TECs contribuent activement à la mise en place d’un TME points favorable en carcinome colorectal humain (CRC)8.

Études antérieures ont tenté d’isoler cet humain de tumeurs solides. Un objectif important de ces études a été, par exemple, l’identification de nouvelle tumeur cellules endothéliales marqueurs (TEMs)9. Une stratégie d’utilisation immédiate de TECs après que microdissection laser a été appliquée afin d’éviter l’altération ou la perte du phénotype TEC dans la culture. Toutefois, des études de suivi identifiées une population contaminante des cellules murales comme un sérieux inconvénient de cette approche10. Notre laboratoire a été le premier à élaborer un protocole qui a permis l’isolement de TECs purs et viables de humaine CRC patients6,7. Une approche avec plusieurs tours de sélection (MACS) cellule magnétique de cet qui assuraient la grande pureté des cultures isolées d’EC a été choisie. Cependant, cette approche exige une période de culture relativement long (6 semaines en moyenne), qui a augmenté le risque d’artefacts induite par la culture. Donc, dans l’étape suivante, le but était de réduire le temps de culture entre la chirurgie et la récolte de la première culture pure. Pour atteindre cet objectif, un protocole amélioré utilisant une dissociation combiné mécanique et enzymatique basée sur du tissu de la tumeur primitive, suivie par cellule à fluorescence activé (FACS) de tri-Tri de triple-étiqueté EC, a été développé. Cela réduit les temps d’isolement en moyenne à trois semaines, résultant dans des cultures pures de TEC et NEC avec une viabilité accrue pour des études fonctionnelles. Isolement des cultures pures viables TEC et NEC de tissus humains avec des taux de réussite élevé peut ouvrir de nouvelles avenues patient spécifique dépistage des drogues au cours de l’élaboration des schémas de traitement individualisé. L’approche de l’isolement est détaillée dans les paragraphes qui suivent.

Protocol

Le processus d’isolement a été approuvé par le Comité local d’éthique de l’Université médicale Centre Erlangen (#159_15 B, gommariadiods-étude). Critères d’inclusion de patients étaient les suivantes : CRC, UICC étape I-IV, aucun antécédent de maladie inflammatoire de l’intestin et aucun traitement néoadjuvant. 1. chirurgie et préparation du tissu pour l’isolement de la cellule unique Obtenir l’échantillon par chirurgie chez un patient CRC (tissu carcinome > 0,5 g, tumeur non-nécrotique centrale ; les tissus normaux du côlon > 10 cm éloigné du site de la tumeur). Les morceaux de tissus obtenus sont pour la plupart 1 g pour le côlon normal. Si pièces > 1 g sont obtenues, les diviser en plusieurs morceaux 1 g en utilisant un scalpel fraîche pour transformation ultérieure de tissu.Remarque : Si le morceau de tissu de tumeur est inférieure à 0,5 g dès le début, l’isolement habituellement échoue. Frais virés fixées des pièces de tissu à l’aide d’une pince stérile dans 40 mL de glace froides Hanks balanced solution saline (HBSS) additionnée de pénicilline/streptomycine/amphotéricine B (1 % HBSS-stylo/strep/ampho) dans des tubes à centrifuger de 50 mL et de les transférer rapidement à la laboratoire.NOTE : Tissus de Colon sont souvent fortement contaminées par les bactéries/champignons dès le début. Pendant toute la procédure d’isolement, stylo/strep/ampho s’ajoutent à toutes les solutions afin d’éliminer les organismes contaminants. Lavez chaque morceau de tissu au moins 4 fois avec de la glace 40 mL froid HBSS-stylo/strep/ampho (Voir l’étape 1.3) dans des tubes à centrifuger de 50 mL en transférant les morceaux de tissu dans l’ordre de tube à un centrifuger vers le tube suivant à l’aide d’une pince stérile. Pinces propres après chaque étape avec l’éthanol à 70 %. Utiliser forceps distinct pour le carcinome et de morceaux de tissus du côlon normal. Peser tous les morceaux de tissu.Remarque : Ne mettez pas de morceaux de tissu directement sur une balance pour la pesée. Après le lavage, peser le dernier tube à centrifuger contenant les tissus avant et après avoir entré les morceaux de tissu. Calculer le poids des pièces de tissu individuels par soustraction. 2. génération de Suspension monocellulaire Remarque : Il est recommandé de garder le tissu hydraté en permanence. Si elle existe, supprimer fat attaché, autres tissus non tumorales ou pièces de tissu nécrosé potentiellement dans l’échantillon de chirurgie en transférant les morceaux de tissus dans un Pétri de la culture de cellule stérile à l’aide d’une pince stérile. Garder les morceaux de tissus hydratés à tout moment en ajoutant 3 à 5 mL de HBSS-stylo/strep/ampho. Couper les morceaux de tissu à l’aide d’un scalpel stérile fraîche (Figure 1). Consulter un pathologiste au cas où l’identification de tissu n’est pas claire. Émincer les tissus restants en petits morceaux (environ 2 × 2 × 2 mm3) en utilisant un scalpel fraîche à lame courbe. Transfert de morceaux de tissus avec une pince stérile dans des tubes de dissociation tissulaire (par exemple, les tubes de gentleMACS C) pré-remplie avec pré chauffé (37 ° C) milieu de culture cellulaire (Dulbecco´s modification moyenne moyenne basale [DMEM] d’aigle) selon les directives du fabricant instructions.NOTE : Essayez d’utiliser le scalpel comme un outil de bascule. Pas presser les cellules afin d’éviter des lésions tissulaires. Morceaux de tissu Digest/dissocier en utilisant un dissociator de tissu (comme gentleMACS Octo Dissociator) en combinaison avec le kit de dissociation de tumeur des tissus humains en suivant les instructions du programme « 37C_h_TDK_1 » a la suite de la manufacturer´s. Centrifuger les tubes de dissociation pendant 1 min à 300 x g à la température ambiante (RT). Ajouter 10 mL de pré chauffé (37 ° C) DMEM additionné de 0,5 % de sérum bovin foetale (FBS) (DMEM-Low) dans chaque tube à l’aide d’une pipette sérologique et filtrer la suspension de cellules à l’aide d’une passoire de cellule (taille des pores 100 µm) au sommet d’un tube à centrifuger de 50 mL en pipettant également, la cellule suspension sur le dessus du filtre. Ajouter 10 mL de DMEM-bas encore une fois pour chaque Mac-tube par une pipette sérologique et transférer les cellules restantes à la crépine de la cellule sur le dessus du tube à centrifuger de 50 mL. Lavez le tamis cellulaire une fois avec une autre 10 mL de milieu DMEM-basse à l’aide d’une pipette sérologique. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 7 min à 300 x g à RT et jeter le surnageant. Remettre en suspension des cellules dans 5 mL de milieu basal endothélial préchauffé (EBM) -2-microvasculaire (MV) additionné (Lonza) stylo/strep/ampho dans le même tube à centrifuger de 50 mL. Suspension cellulaire de plaque dans un flacon de culture cellulaire T-25 revêtu du jour au lendemain avec 1,5 % salin de gélatine-tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C et 5 % de CO2, laver les cellules deux fois soigneusement avec environ 5 mL de PBS et ajouter 5 mL de milieu frais. Cultiver les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu’à la confluence (habituellement 5-7 jours) de 80 à 90 % avec 48 h d’intervalle de renouvellement du milieu. 3. tri des FACS des cellules endothéliales NOTE : Essayez de ne pas perdre les cellules à tout moment, par exemple en limitant la procédure de marquage à l’incubation des cellules dans un tube unique réactif. Détacher les cellules avec 1 mL d’accutase (environ 10 min) et ajouter 4 mL de milieu de EBM-2-MV préchauffé (37 ° C). Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’une cellule automatisée (gamme 10-25 µm) de dispositif de comptage. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 4 min avec 250 g de x à ta et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules pré chauffé FACS-tampon (solution de PBS 1 x, 2,5 % albumine de sérum [BSA], 5 mM EDTA pH 8.0, 10 µM Y-27632) selon le nombre de cellules (5 x 106/ml). Ajouter anticorps FACS-coloration selon le volume cellulaire comte/FACS-tampon : CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/vasculaire endothéliale (VE) – cadhérine – PE (100 µL/mL = 1/10), CD105-APC (25 µL/mL = 1/40), mélanger et laisser incuber à 7 min à ta abri de la lumière ; doucement, effleurez et incuber pendant 8 min (pour un temps d’incubation totale de 15 min). Ajouter 2 mL de tampon de FACS à la suspension de cellules marquées à l’aide d’une pipette sérologique. Centrifuger pendant 4 min avec 250 g x RT et jeter le surnageant. Laver deux fois en ajoutant 2 mL de tampon de FACS et procéder à une centrifugation ultérieure pendant 4 min à 250 x g à RT et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules de 500 µL de préchauffé EBM-2-MV-stylo/strep/ampho et cellules de transfert à l’instrument de tri des FACS. Les cellules endothéliales mourra rapidement pendant le processus de tri si l’instrument de FACS est refroidi. Par conséquent, effectuer le tri des cellules endothéliales à RT et transférer immédiatement les cellules recueillies dans l’incubateur à 37 ° C par la suite.Remarque : Le FACS-instrument est généralement non stérile ! Cellules positives à triple tri/perçu directement dans un plat de culture cellulaire (par exemple, la plaque 24 puits revêtu du jour au lendemain avec 1,5 % de gélatine-PBS) rempli de 0,5 mL de milieu frais préchauffé (EBM-2-MV-stylo/strep/ampho).Remarque : Vérifier la suspension cellulaire après un tri à l’aide d’un microscope. Si les cellules cluster ensemble, essayez d’obtenir une répartition égale de cellule dans le plat de la culture de cellules en les mélangeant lentement ou en ajoutant des moyennes. Cultiver des cellules jusqu’à la confluence de 90 à 100 % avec 48 h d’intervalle de renouvellement du milieu et de développer les cellules à la taille de plat de culture souhaité (plaque 24 puits → 12 puits-plaque → 3,5 cm plat → T-25 → T-75). 4. la récolte et la caractérisation des cellules endothéliales Pure Cellules à confluence de 90-100 % de la récolte et les caractériser par une méthode appropriée (p. ex., FACS, cytochimie, PCR quantitative (qPCR) ou cellules endothéliales fonction dosages7,8). Analyser les cellules isolées avec quelle que soit la méthode de caractérisation est choisie.

Representative Results

L’isolement de NEC et TEC de CRC humaine par une dissociation combiné mécanique/enzymatical tissu, suivie ultérieurs CD31/CD105/VE-cadhérine-driven FACS-tri est décrite ici (Figure 1A). Ce protocole représente un protocole amélioré avec une fenêtre de temps réduit jusqu’à la première récolte des cellules endothéliales pures et viables par comparaison avec le précédent protocole Mac basé sur7. NEC et TEC ont été isolés des humain CRC en suivant les étapes suivantes : (1) génération d’une suspension monocellulaire de dissociation combiné mécanique et enzymatique des tissus et la croissance de ces cellules à confluence de 80 à 90 % (Figure 1), (2) triple marquage de la Communauté européenne par les anticorps couplés fluorochrome CD31/CD105/VE-cadhérine et FACS-tri (3) des cellules positives triple respectifs (Figure 2A). À noter, une étape cruciale pour le succès de la procédure d’isolement et de la viabilité des cellules doit rapidement soumettre le spécimen de chirurgie à la technique d’isolation (génération de suspension monocellulaire < 1 heure après résection). À l’aide de FACS-tri, une moyenne de 12 500 TEC (n = 12) et 17 800 NEC (n = 12, Figure 2B, à gauche) ce qui représente une moyenne de 3,6 et 5,6 % de la population totale de cellules (Figure 2B, droite) a pu être isolé. Par la suite, les cellules ont été élargis jusqu’à T-75 (appelé passage 1) et exploitée et surtransformé pour analyse. À noter, en utilisant le protocole précédent axée sur les MACS, un succès d’isolement moyen de 49,6 % a été atteint (n = 58 TECs pures de n = 117 patients8) avec EC pure cultures disponibles en moyenne 6 semaines après la chirurgie. Utilisant le nouveau protocole axée sur les FACS décrit ici, les premières cultures pures d’EC ont été obtenues d’en moyenne 3 semaines après la chirurgie avec un taux de réussite d’isolement de 62,1 % (n = 41 cultures pures d’EC obtenus à partir de n = 66 unique soumises aux FACS-tri des suspensions de cellules). Ainsi, une augmentation du taux de 12,5 % d’isolation a été réalisée en parallèle avec une diminution de la durée de culture de 6 à 3 semaines. Cette réduction de la durée de la culture a conduit à la viabilité cellulaire améliorée et prolonge la durée de vie accompagnée d’une exposition moindre à l’induction d’éventuels artefacts spécifiques à une culture des cultures établies. Caractérisation de la pureté de l’EC a été menée d’abord par CD31-cytochimie (Figure 3A). Si les cultures étaient dépourvues de cellules CD31-négatifs (Figure 3A, TEC et NEC), ils ont été soumis à une cellule plus détaillée en tapant par transcription inverse quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) (Figure 3B). Type cellulaire des amorces spécifiques pour ce (CD31, CD105, VE-cadhérine et von Willebrand factor [vWF]), leucocytes (CD45), cellules épithéliales (cytokératine [CK] -20) et les cellules musculaires lisses/fibroblastes (desmine) ont été utilisées (Figure 3B). En utilisant cette base de qPCR cell tapant, une éventuelle contamination des cultures EC par les autres cellules de la plage de 0, 1 – 2 %, selon le type de cellule, peut être détecté8. Notamment, nous avons déjà indiqué une perte préférentielle de l’expression de protéines de vWF dans les cultures de TCE par rapport à leurs correspondants de cultures NEC7. Ces résultats ont pu être confirmées avec le protocole d’isolement nouvellement établi (Figure 3C, signifier la perte de Ct NEC-TEC = 0,687, p = 0,173, jumelé t-test). Cultures en passant avec succès ces contrôles de qualité ont été testés pour les infections à mycoplasma et par la suite utilisés pour d’autres expériences. Figure 1 : Cellules endothéliales purs peuvent être isolés du côlon normal humain et CRC en triant les FACS. (A) Organigramme des étapes essentielles du processus d’isolement EC. (B) (jaune), d’autres pièces non tumorales ou pièces de tissu nécrosé potentiellement (brun) ont été retirés de l’échantillon de chirurgie (panneau de gauche et du milieu) et la tumeur a été désintégrée en cubes de 2-3 mm côté avant (dissociation) tissu adipeux panneau de droite). (C), la seule cellule suspension Récupérée après que dissociation tissulaire (panneau de gauche) est incubée pendant 24 h dans les récipients de culture cellulaire. Par la suite, les cellules non adhérentes ont été éliminés par lavage doux à l’aide de PBS (panneau central) et les cellules ont été cultivés à la confluence de 80 à 90 % avant le tri des FACS (panneau de droite). Les images du panneau inférieur (C) ont été acquises par microscopie à contraste de phase. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Une moyenne de 3,6 à 5,6 % de la suspension cellulaire unique isolées de patients humains de CRC et tri par FACS étaient séropositifs au triple EC. (A) NEC et TEC étaient FACS-triés à l’aide un triple marquage des cellules avec des anticorps anti-CD31, – CD105 et – VE-cadhérine. (B), une moyenne de 12 500 TEC (n = 12) et 17 800 NECs (n = 12) peut être isolé du côlon normal humain ou CRC à l’aide de FACS-tri (CD31 CD105 VE-cadhérine positive des cellules et panneau latéral gauche), qui représente en moyenne 3,6 et 5,6 % (panneau de droite) de la cellule totale population employée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : NEC et TEC de CRC humain expriment des marqueurs de cellules endothéliales typique. Les cellules endothéliales du côlon normal (NEC, n = 10) et les cellules endothéliales tumorales (TEC, n = 10) du CRC humaine sont CD31 (marqueur de l’EC)-, CD105 (marqueur de l’EC)-, VE-cadhérine (marqueur de l’EC)-, le vWF (marqueur de l’EC) – positive et CK20 (marqueur de cellules CRC)-, desmine (marqueur de fibroblaste/SMC)-, CD45 ( marqueur de leucocyte)-négatif tel que déterminé par (A) CD31-immunocytochimie (cellules positives = rouge) et (B) RT-qPCR (données points au-dessous de la ligne en pointillés sont les échantillons détectés comme négatif). Expression de vWF (C) tel que déterminé par la RT-qPCR pour échantillons TEC/NEC correspondants chez les mêmes patients. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Principalement, trois méthodes différentes ont été utilisées jusqu’à présent pour pure et viable NECs et TECs isolent humains tissus solides, à savoir (1) immunomagnetic enrichissement, microdissection laser (2) et (3) Tri des FACS de la fraction de l’EC. Dans la plupart des publications, immunomagnetic l’enrichissement des cellules après la génération d’une suspension monocellulaire de désagrégation mécanique a été utilisée11,12,13. Par exemple, immunomagnetic purification de ce microvasculaire cutanée humaine (HDMEC) par E-sélectine des anticorps après le facteur de nécrose tumorale (TNF)-traitement α de prépuces néonatale13 a été signalé pour l’isolement des humains ce à partir de gliome de tissu digérer, gradient de percoll et sélection à l’aide d’anti-CD31/CD105 et VE-cadhérine-anticorps12, ou par les anticorps anti-CD105 d’être humain breast cancer11. Protocoles utilisés microdissection laser ou triage FACS ont été moins fréquemment rapportés. Microdissection laser a été utilisée, par exemple, pour identifier les potentiel pan-tumeur marqueurs de cellules endothéliales (TEMs) dans EC dérivé de carcinome colorectal humain avec l’analyse des cellules immédiatement après dissection9. Tri des FACS utilisant des anticorps-anti-CD31 a fait pour l’isolation de la fraction de l’EC d’embryonnaires non différenciées humaines14de cellules souches.

Ces approches ont différents avantages et inconvénients qui doivent être considérés. Les avantages de l’approche axée sur l’immunomagnetic sont que n’exige aucun équipement élaboré, la sélection peut être effectuée à tout moment, et l’enrichissement de la cellule est rapide (environ 15 min) par rapport aux FACS-tri (environ 1 h). L’absence de matrice pour une plus longue période de temps peut induire la mort cellulaire d’EC par anoikis. Donc, ajout de l’inhibiteur de kinase rho Y-27632 dans la mémoire tampon de FACS a été employée pour empêcher cell anoikis15.

Les inconvénients de l’enrichissement de l’immunomagnetic sont que plusieurs cycles de sélection sont nécessaires afin d’atteindre la pureté supérieure à 99 %. Par ailleurs, culture cellulaire entre enrichissements est nécessaire pour la récupération de cellules, ce qui augmente l’âge des cultures soutenant les artefacts induite par la culture. Microdissection de laser a l’avantage que les cellules peuvent être utilisés immédiatement qui réduit les artefacts induite par la culture mais inclut le risque de contamination par des cellules de tissus adjacents zones10. En outre, microdissection n’est pas établie dans chaque laboratoire. Les inconvénients de l’approche de FACS-tri-basé incluent, semblable au laser microdissection, que l’équipement est complexe et coûteuse. Ainsi, cet équipement ne peut être accessible à tout moment. Dans un contexte clinique, où la disponibilité des tissus d’intérêt ne peut pas être exactement prévue, cela peut ajouter un autre désavantage.

Toutefois, les principaux avantages de la FACS-tri sont que la fraction de l’EC peut être étiquetée par des anticorps multiples en parallèle. Ainsi, une stratégie de blocage rigoureuse peut être employée qui assurent un haut degré de pureté. Ne basé sur l’expérience, aucun nouveau tri de la fraction EC était tenue, par contraste avec le protocole précédent axée sur les MACS où plusieurs tours de sélection devaient servir. Cela a conduit à un temps de culture significativement réduite jusqu’à la pureté de six semaines (approche de MACS) à trois semaines à l’approche de FACS, ce qui entraîne une meilleure viabilité de cellules permettant une fenêtre de temps prolongée d’analyse. Enfin, une amélioration de la taux de réussite global d’isolation à l’aide de la stratégie de base de FACS-tri, pourrait être atteint (augmentation de 12,5 %). En conclusion, le tri des FACS a établi les 3 anticorps employant stratégie en parallèle après que digest de tissus par digestion combiné tissu mécanique et enzymatique présentait des avantages nombreux qui a établi ce protocole comme la méthode de choix pour l’isolement des TECs et NECs de carcinome colorectal humain et du côlon.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (Division de moléculaire et chirurgie expérimentale), Uwe Appelt, Michael Mroz (tri-Core unité FACS) et Simon Völkl (unité de base FACS-Immunomonitoring) pour son aide technique. Ce travail a été soutenu par subventions fr/SP du Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (IZKF) de l’Université médicale Centre Erlangen, la Fondation de recherche allemande (DFG : pour 2438, SP2) et la Fondation Lutz, grâce à une subvention de la Fondation Pfleger-Robert VSS ainsi que par les subventions accordées à la SP depuis la Fondation de recherche allemande [DFG : KFO257 (sous-projet 4), SFB 796 (sous-projet B9)].

Materials

HBSS 1x Gibco by Life Technologies 14175-053
Penicillin-streptomycin Gibco by Life Technologies 15140-122
amphotericin B Gibco by Life Technologies 15290-026
Scalpels, disposable Feather No. 23
gentleMACS octo dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
gentleMACS C-tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
human tumor dissociation kit Miltenyi Biotec 130-095-929
DMEM Gibco by Life Technologies 21969-035
EGM-2-MV BulletKit Lonza CC-3202
Cell strainer, 100 µm Falcon 352360
StemPro Accutase  Gibco by Life Technologies A11105-01
Cell counter, automated Coulter Counter Z1
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
CD31-FITC BD Pharmingen 555445
CD144/VE-cadherin-PE BD Pharmingen 560410
CD105-APC BD Pharmingen 562408
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9391
FACS-Sorting device Beckman Coulter MoFlo XDP
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References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  4. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  5. Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
  6. Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
  7. Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
  8. Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
  9. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  10. Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
  11. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
  12. Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
  13. Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
  14. Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).

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Naschberger, E., Regensburger, D., Tenkerian, C., Langheinrich, M., Engel, F. B., Geppert, C., Hartmann, A., Grützmann, R., Schellerer, V. S., Stürzl, M. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. J. Vis. Exp. (134), e57400, doi:10.3791/57400 (2018).
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