Isolatie van menselijke endotheliale cellen van normale Colon en colorectaal carcinoom - een verbeterde Protocol

Het proces van isolement is goedgekeurd door de lokale ethische commissie van de Universiteit medisch centrum Erlangen (#159_15 B, TuMiC-studie). Patiënt inclusie criteria waren als volgt: CRC, UICC fase-IV, geen geschiedenis van inflammatoire darmziekte, en geen neoadjuvante behandeling. 1. operatie en voorbereiding van weefsel voor eencellige isolatie Specimen door chirurgie te verkrijgen door een CRC-patiënt (carcinoma weefsel > 0,5 g, centraal niet-necrotische tumor; normaal weefsel van de dikke darm > 10 cm verre van tumor site). Het verkregen weefsel stukken zijn meestal 1 g voor de normale dikke darm. Als stukken > 1 g worden verkregen, opgesplitst in meerdere 1 g stukken met behulp van een verse scalpel voor verdere verwerking van het weefsel.Opmerking: Als de tumor weefsel stuk lager dan 0,5 g vanaf het begin is, het isolement meestal mislukt. Verzamel verse niet vastgelegde weefsel stukken met behulp van steriele pincet in 40 mL ijs koud Hanks evenwichtig zoutoplossing (HBSS) aangevuld met penicilline/streptomycine/amphothericin B (1% HBSS-pen/strep/ampho) in 50 mL centrifuge buizen en breng ze snel op de laboratorium.Opmerking: Weefsel van de dikke darm is vaak sterk verontreinigd met bacteriën/schimmels vanaf het begin. Tijdens de hele procedure van isolatie, moet pen/strep/ampho worden toegevoegd aan alle oplossingen om het elimineren van contaminerende organismen. Wassen elk stukje weefsel minstens 4 keer met 40 mL ijs koud HBSS-pen/strep/ampho (zie stap 1.3) in 50 mL centrifuge buizen door de stukjes weefsel opeenvolgend van een centrifugebuis aan de volgende buis met behulp van steriele pincet. Schone pincet na elke stap met 70% ethanol. Gebruik aparte pincet voor de carcinoom en normale colon weefsel stukjes. Weeg alle weefsel stukken.Opmerking: Plaats geen weefsel stukken direct op een schaal voor het wegen. Na het wassen, wegen de laatste centrifugebuis met het weefsel vóór en na het invoeren van de stukjes weefsel. Bereken het gewicht van individuele weefsel stukken door aftrekking. 2. productie van eencellige schorsing Opmerking: Het wordt aanbevolen om te houden van het weefsel gehydrateerd te allen tijde. Als dit bestaat, bijgevoegde vet, andere niet-tumorous weefsel of verwijderen potentieel necrotisch weefsel delen van het model van de operatie door de overdracht van de stukken van het weefsel in een steriele cel cultuur petrischaal met steriel pincet. Houd de stukken van de weefsel gehydrateerd op alle tijden door toevoeging van 3-5 mL HBSS-pen/strep/ampho. Trim de stukken van de weefsel met behulp van een verse steriel scalpel (Figuur 1). Raadpleeg een patholoog in het geval dat weefsel identificatie is onduidelijk. Resterende weefsel in kleine stukjes gehakt (ongeveer 2 × 2 × 2 mm3) met behulp van een verse scalpel met een gekromd lemmet. Overdracht van stukken van de weefsel met steriel pincet in weefsel dissociatie buizen (bijvoorbeeld, gentleMACS C buizen) vooraf gevuld met voorverwarmde (37 ° C) cel kweekmedium (Dulbecco´s modified eagle middellange [DMEM] Basaal medium) volgens de fabrikant instructies.Opmerking: Probeer te gebruiken de scalpel als een rockende hulpmiddel. Knijp de cellen niet om weefselschade te voorkomen. Digest/distantiëren weefsel stukken met behulp van de dissociator van een weefsel (zoals gentleMACS Octo Dissociator) in combinatie met de tumor dissociatie kit voor menselijk weefsel met behulp van de instructies van het programma “37C_h_TDK_1” na de manufacturer´s. Centrifugeer dissociatie buizen voor 1 min bij 300 x g bij kamertemperatuur (RT). Voeg 10 mL van de voorverwarmde (37 ° C) DMEM aangevuld met 0,5% foetale runderserum (FBS) (DMEM-Low) aan elke buis met behulp van een precisiepipet serologische en filteren van de celsuspensie met behulp van een cel zeef (100 µm poriegrootte) op de top van een 50 mL centrifugebuis waarbij de cel vering op de top van het filter. Voeg 10 mL voor DMEM-Low opnieuw aan elke MACS-buis door een serologische pipet en overdracht van resterende cellen naar de zeef van de cel op de top van de centrifugebuis van 50 mL. De zeef van de cel een keer met een extra 10 mL DMEM-laag-medium met behulp van een precisiepipet serologische wassen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 7 minuten bij 300 x g bij RT en weggeworpen. Resuspendeer de cellen in 5 mL van voorverwarmde endothelial Basaal medium (EBM) -2-microvasculaire (MV)-medium (Lonza) aangevuld met pen/strep/ampho in de dezelfde 50 mL centrifugebuis. Celsuspensie van de plaat in een T-25 cel cultuur maatkolf van vooraf gecoat ‘s nachts met 1,5% gelatine-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C met 5% CO2. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2, de cellen twee keer wassen zorgvuldig met ongeveer 5 mL PBS en voeg 5 mL van verse medium. De cellen bij 37 ° C en 5% CO2 tot 80-90% confluentie (gewoonlijk 5-7 dagen) met 48 h intervallen van mediumverversing cultiveren. 3. FACS-sorteren van endotheliale cellen Opmerking: Probeer te vermijden dat verliezen van cellen op elk gewenst moment, bijvoorbeeld door de kleuring procedure incubatie van de cellen in een buis van één reagens te beperken. Loskoppelen van cellen met 1 mL accutase (ongeveer 10 min), en voeg 4 mL van voorverwarmde (37 ° C) EBM-2-MV medium. Het bepalen van het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde cel tellen apparaat (bereik 10 tot 25 µm). Centrifugeer celsuspensie voor 4 min met 250 x g bij RT en weggeworpen. Resuspendeer de cellen in voorverwarmde FACS-buffer (1 x PBS, 2,5% bovien serumalbumine [BSA], 5 mM EDTA pH 8.0, 10 µM Y-27632) volgens cel tellen (5 x 106/mL). Toevoegen van FACS-kleuring antilichamen volgens cel graaf/FACS-buffervolume: CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/vasculaire endothelial (VE) – cadherine – PE (100 µL/mL = 1/10), CD105-APC (25 µL/mL = 1/40), meng en incubeer gedurende 7 minuten op RT beschermd tegen licht; zachtjes flick en incubeer gedurende een ander 8 min (voor een totale incubatietijd van 15 min). Voeg 2 mL FACS-buffer tot de schorsing van de gelabelde cel met behulp van een precisiepipet serologische. Centrifugeer gedurende 4 min met 250 x g bij RT en weggeworpen. Twee keer wassen door toevoeging van 2 mL van FACS-buffer, en voeren een latere centrifugeren voor 4 min bij 250 x g bij RT en weggeworpen. Resuspendeer de cellen in 500 µL voorverwarmde EBM-2-MV-pen/strep/ampho en overdracht cellen naar het instrument FACS-sorteren. Endotheliale cellen zal snel sterven tijdens het sorteren proces als het FACS-instrument wordt gekoeld. Daarom voeren sorteren van endotheliale cellen bij RT en onmiddellijk overbrengen in de verzamelde cellen de 37 ° C incubator daarna.Opmerking: Het FACS-instrument is meestal niet-steriel! Sorteren/verzamelen triple-positieve cellen rechtstreeks in een cel cultuur schotel (bijvoorbeeld 24-well plaat vooraf gecoat ‘s nachts met 1,5% gelatine-PBS) gevuld met 0,5 mL voorverwarmde verse voedingsbodem (EBM-2-MV-pen/strep/ampho).Opmerking: Controleer celsuspensie na het sorteren met behulp van een microscoop. Als de cellen cluster samen, proberen te verkrijgen van een zelfs cel distributie in de cel cultuur schaal door hen langzaam mengen of het toevoegen van medium. Cellen tot 90-100% confluentie met 48 h intervallen van mediumverversing cultiveren en de cellen uit te breiden tot de grootte van de schotel gewenste cultuur (24-well plaat → 12 well-plate → 3,5 cm schotel → T-25 → T-75). 4. de oogst en karakterisering van Pure endotheliale cellen Oogsten van cellen op 90-100% confluentie en karakteriseren ze door een geschikte methode (bijvoorbeeld, FACS, cytochemie, kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) of endothelial cel functie testen7,8). Analyseren van geïsoleerde cellen met ongeacht welke methode van karakterisering is gekozen.