عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين
Summary
ورم خلايا بطانية هي محددات هامة لورم المكروية ومسار المرض. ويرد هنا، بروتوكولا لعزل خلايا بطانية نقية وقابلة للحياة من الإنسان من سرطان القولون والمستقيم والقولون العادي لاستخدامها في بحوث المخدرات اختبار والمرضية.
Abstract
الخلايا الأولية المعزولة من السرطانات البشرية أدوات قيمة لتحديد الآليات المسببة للأمراض التي تسهم في التنمية المرض والتقدم. على وجه الخصوص، خلايا بطانية (الجماعة الأوروبية) التي تشكل السطح الداخلي للسفن، مباشرة المشاركة في إيصال الأكسجين، والإمداد بالمواد الغذائية وإزالة النفايات، ومن الأورام، ومما شكل بارز يشارك في الدستور للورم المكروية (TME). ورم خلايا بطانية (تيكس) يمكن استخدامها كأجهزة استشعار العوامل البيولوجية الخلوية من المكروية intratumoral أنشأتها الاتصالات بين الورم والخلايا اللحمية. تيكس أيضا بمثابة أهداف للعلاج. تبعاً لذلك، تسمح هذه الخلايا في ثقافة الدراسات على آليات الاستجابة أو مقاومة للعلاج المضادة-الأوعية. في الآونة الأخيرة، وجد أن تيكس معزولة عن البشرية سرطان القولون (CRC) معرض الذاكرة مثل الآثار استناداً إلى TME محددة أنها مستمدة من. علاوة على ذلك، تيكس هذه المساهمة بنشاط في إنشاء TME محددة بإفراز عوامل مختلفة. على سبيل المثال، تيكس في مواتي إنذاريا Th1-TME تفرز البروتين عامل الورم القمعية يفرز الأوعية المضادة، الحمضية والغنية في 1 مثل السيستين (SPARCL1). ينظم التوازن السفينة SPARCL1 ويحول دون انتشار الخلايا السرطانية والهجرة. ومن ثم فثقافات تيكس نقية وقابلة للبقاء معزولة عن الأورام الصلبة البشرية أداة قيمة للدراسات الفنية بشأن دور نظام الأوعية الدموية في توموريجينيسيس. ويرد هنا، أحدث بروتوكول جديد لعزل المفوضية الأوروبية الأولية من القولون العادي، فضلا عن اتفاقية حقوق الطفل. الأسلوب الذي يستند إلى هضم الأنسجة الميكانيكية والانزيميه، إيمونولابيلينج، والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)-فرز الخلايا إيجابية الثلاثي (CD31، هاء-كادهيرين، CD105). مع هذا البروتوكول، يمكن أن تكون التكنلوجيا قابلة للتطبيق أو الثقافات الخلية غشائي عادي (NEC) المعزولة من أنسجة القولون مع معدل نجاح 62.12 في المائة عند تعرضه للفرز من نظام مراقبة الأصول الميدانية (الثقافات الأوروبية البحتة 41 من عينات الأنسجة 66). وبناء على ذلك، يوفر هذا البروتوكول نهجاً قويا لعزل الثقافات الإنسانية من المفوضية الأوروبية من القولون العادي واتفاقية حقوق الطفل.
Introduction
وورم المكروية (TME) يعرف تفاعل وثيق بين الخلايا السرطانية مع ستروما الورم، التي تتألف من الخلايا مثل خلايا بطانية (EC) بيريسيتيس، والخلايا الليفية، وخلايا العضلات الملساء أو الخلايا المناعية. الاتصال بين هذه المكونات الخلوية يمكن أن تكون مدفوعة بعوامل paracrine (مثل عوامل النمو الأوعية، السيتوكينات)، المصفوفة خارج الخلية، أو الاتصال المباشر خلية خلية. حجرة stromal قد تعزز أو مواجهة بدء الورم أو التدرج، اعتماداً على TME محددة المنشأة.
قدرة الورم على الاتصال مع نظام السفينة مفتاح التقدم وورم خبيث من هذا المرض. ويتيح هذا النظام السفينة الورم في الغالب للوصول إلى إيصال الأوكسجين والمواد الغذائية، فضلا عن إزالة النفايات1،،من23. المفوضية الأوروبية تشكل السطح الداخلي للسفن، ولذلك المكونات الخلوية الهامة التي تشارك بنشاط في هذه العملية. فمن المعروف جيدا أن ورم خلايا بطانية (TEC) مختلفة للخلايا المناظرة لها عادي غشائي (NEC) بالعديد من الميزات مثل اضطراب التسلسل الهرمي شجرة الأوعية الدموية، يجتازها السفينة، أو تخفيض نضوج المتمثلة في تخفيض عدد خلايا بيريسيتيس/الجدارية المرفقة فقط فضفاضة ب الجماعة الأوروبية4.
ومن ثم تيكس أدوات الخلوية قيمة لدراسة التسرطن. واعتبرت تيكس أساسا لتعزيز نمو وتطور الورم3. وهكذا، يمكن استخدام تيكس كأجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي تسمح برصد وتحديد العمليات المسببة للمرض التي بدء أو تشجيع أو مواجهة tumorigenesis. وعلاوة على ذلك، فهي الأهداف العلاجية في العيادة5. التالي، تيكس معزولة ونيكس المقابلة أيضا يمكن استعمالها كأدوات لفهم آليات الاستجابة أو مقاومة للعلاج المضادة-الأوعية.
في الماضي، وضعت بروتوكولا لعزل هذه الخلايا6،7 ، وحددت أن تيكس لا تختلف عن نيكس فقط، ولكن أيضا تختلف عن بعضها البعض حسب TME أنها مستمدة من8. من خلال هذا النهج، يتضح أن تيكس في بعض تميس يمكن التصدي بنشاط نمو الورم والتدرج من إفراز البروتينات المضادة-الأوعية الورم القمعية مثل SPARCL1. وأشار هذا إلى أن تيكس تسهم بنشاط في إنشاء TME إنذاريا مواتية في سرطان القولون والمستقيم البشرية (CRC)8.
الدراسات السابقة التي حاولت عزل تيكس البشرية من الأورام الصلبة. كان هدفا هاما لهذه الدراسات، مثلاً، تحديد هوية جديدة ورم الخلايا غشائي علامات (تيمس)9. وضع استراتيجية للاستخدام الفوري من تيكس بعد تم تطبيق ميكروديسيكشن الليزر لتجنب تغيير أو فقدان النمط الظاهري المجلس التنفيذي الانتقالي في الثقافة. ومع ذلك، حددت دراسات المتابعة سكان تلويث الخلايا الجدارية كعيب خطير من هذا النهج10. وكان لدينا مختبر الأول من وضع بروتوكول يسمح بعزل تيكس نقية وقابلة للبقاء من المرضى CRC البشرية6،7. واختير نهج مع الخلية المغناطيسي التحديد (ماك) جولات متعددة من تيكس تكفل درجة نقاء عالية للثقافات الأوروبية معزولة. بيد أن هذا النهج يتطلب فترة طويلة نسبيا زراعة (6 أسابيع في المتوسط)، مما زاد من خطر الآثار الناجمة عن الثقافة. ومن ثم، في الخطوة القادمة، يهدف إلى تقليل وقت زراعة بين الجراحة وحصاد الثقافة النقية الأولى. لتحقيق هذا الهدف، بروتوكولا تحسين توظيف تفكك نسيج الميكانيكية والانزيميه على أساس الجمع بين الورم الأولى، تليها fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)-الفرز من المفوضية الأوروبية المسماة ثلاثية، وقد وضعت. خفض هذا الوقت العزلة في المتوسط إلى ثلاثة أسابيع، أسفر عن الثقافات المجلس التنفيذي الانتقالي واللجنة الانتخابية الوطنية الصرفة مع إمكانية زيادة للدراسات الفنية. عزل نقية الثقافات المجلس التنفيذي الانتقالي واللجنة الانتخابية الوطنية قادرة على البقاء من الأنسجة البشرية مع معدلات نجاح عالية قد فتح آفاقاً جديدة لاختبار أثناء تطوير نظم العلاج الفردي العقاقير الخاصة بالمريض. نهج العزل بالتفصيل في الفقرات التالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أساسا، استخدمت ثلاث طرق مختلفة حتى الآن لعزل نيكس وتيكس نقية وقابلة للبقاء من الأنسجة الصلبة البشرية، إلا وهي تخصيب (1) إيمونوماجنيتيك، ميكروديسيكشن (2) ليزر، و (3) الفرز في نظام مراقبة الأصول الميدانية في كسر المفوضية الأوروبية. في معظم المنشورات، تم تخصيب إيمونوماجنيتيك الخلايا بعد جيل تعليق خلية مفردة بالتفكك الميكانيكية المستخدمة11،،من1213. على سبيل المثال، إيمونوماجنيتيك تنقية للبشرية عن طريق الجلد microvascular “المفوضية الأوروبية” (هدميك) بالأجسام المضادة سيليكتين ه بعد عامل نخر الورم (تنف)-سجلت المعاملة α فوريسكينس حديثي الولادة13 لعزل المفوضية الأوروبية البشرية من الدبقي بالانسجة هضم، بركل التدرج، والتحديد باستخدام مكافحة–CD31/CD105 وهاء-كادهيرين-أجسام12، أو بالأجسام المضادة CD105 من البشرية11من سرطان الثدي. البروتوكولات التي تستخدم الليزر ميكروديسيكشن أو الفرز من نظام مراقبة الأصول الميدانية أبلغ أقل تواترا. تم استخدام الليزر ميكروديسيكشن، على سبيل المثال، لتحديد الورم عموم المحتملة علامات خلية غشائي (تيمس) في المفوضية الأوروبية المستمدة من سرطان القولون والمستقيم البشرية مع تحليل للخلايا مباشرة بعد تشريح9. نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز استخدام مكافحة–CD31–الأجسام المضادة بنجاح تجلى لعزل الكسر الجماعة الأوروبية من جنينية غير متمايزة الإنسان الخلايا الجذعية14.
هذه النهج من مختلف المزايا والعيوب التي يتعين النظر فيها. مزايا للنهج القائم على إيمونوماجنيتيك هي أن مطلوب أي معدات متطورة، ويمكن إجراء التحديد أي وقت، وتخصيب خلية سريعة (حوالي 15 دقيقة) بالمقارنة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز (حوالي 1 ح). الافتقار إلى مصفوفة لفترة أطول من الزمن قد حمل موت الخلية في الجماعة الأوروبية التي anoikis. ولذلك، كان يعمل إضافة مثبطات كيناز رو Y-27632 إلى المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية لمنع الخلية anoikis15.
أن مساوئ تخصيب إيمونوماجنيتيك أن جولات متعددة التحديد مطلوبة من أجل تحقيق نقاء أعلى من 99%. وعلاوة على ذلك، مطلوب زراعة الخلية بين الإثراء لاسترداد الخلية، مما يزيد من عصر الثقافات دعم الآثار الناجمة عن الثقافة. الليزر ميكروديسيكشن قد الميزة التي يمكن أن تكون الخلايا المستخدمة مباشرة مما يقلل من الآثار الناجمة عن الثقافة بل يشمل خطر التلوث بخلايا من النسيج المجاور المناطق10. وعلاوة على ذلك، لا يتم تأسيس ميكروديسيكشن في كل مختبر. وتشمل مساوئ هذا النهج على أساس فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية، مشابهة لليزر ميكروديسيكشن، أن هذه المعدات معقدة وباهظة التكلفة. وبناء على ذلك، هذه المعدات قد لا يكون موجوداً في أي وقت. في وضع سريرية، حيث لا يمكن الضبط المزمع توافر الأنسجة للفائدة، هذا إضافة عيب آخر.
ومع ذلك، هي المزايا الرئيسية لنظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز أن الكسر المفوضية الأوروبية يمكن أن يكون المسمى بأجسام مضادة متعددة في نفس الوقت. وهكذا، يمكن توظيف استراتيجية النابضة صارمة تضمن درجة نقاء عالية. استناداً إلى التجربة، لا إعادة الفرز في كسر الجماعة الأوروبية كان المطلوب، خلافا للبروتوكول المستندة إلى أجهزة ماكينتوش السابقة حيث كان جولات متعددة للاختيار توظيف. وادي ذلك إلى وقت زراعة انخفاضا كبيرا حتى النقاء من ستة أسابيع (نهج أجهزة ماكينتوش) لمدة ثلاثة أسابيع في نهج نظام مراقبة الأصول الميدانية، أسفر عن بقاء خلية محسنة تمكين إطار زمني طويلة لتحليل. أخيرا، باستخدام هذه الاستراتيجية على أساس فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن أن تحسن من معدل نجاح العزل يتحقق (زيادة قدرها 12.5 في المائة). وفي الختام، الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية على أساس استراتيجية توظيف أجسام 3 في نفس الوقت بعد هضم الأنسجة بهضم الأنسجة الميكانيكية والانزيميه مجتمعة قد المزايا العديدة التي أنشأت هذا البروتوكول كأسلوب الاختيار لعزل تيكس ونيكس من الإنسان من سرطان القولون والمستقيم والقولون.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر فليرل المسيحية، بيتر كاتيا، كريستينا Schnürer (كل شعبة من الجزيئية والجراحة التجريبية)، ابيلت آوى، مايكل Mroz (الفرز الأساسية وحدة نظام مراقبة الأصول الميدانية) وسيمون Völkl (الوحدة الأساسية نظام مراقبة الأصول الميدانية-إيمونومونيتورينج) للحصول على المساعدة التقنية الممتازة. هذا العمل كان يدعمها المنح إلى EN/MS من مركز إينتيرديسسيبليناري للبحوث السريرية (إيزكف) من “ارلنجن المركز الطبي في جامعة”، مؤسسة البحوث الألمانية (DFG: ل 2438، SP2) ولوتز شتيفتونغ، بمنحه من روبرت-بفلجر-ستيفتونغ إلى VSS فضلا عن المنح المقدمة لمرض التصلب العصبي المتعدد من “مؤسسة البحوث الألمانية” [DFG: KFO257 (المشروع الفرعي 4)، SFB 796 (المشروع الفرعي B9)].
Materials
| HBSS 1x | Gibco by Life Technologies | 14175-053 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| amphotericin B | Gibco by Life Technologies | 15290-026 | |
| Scalpels, disposable | Feather | No. 23 | |
| gentleMACS octo dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| human tumor dissociation kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| DMEM | Gibco by Life Technologies | 21969-035 | |
| EGM-2-MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Cell strainer, 100 µm | Falcon | 352360 | |
| StemPro Accutase | Gibco by Life Technologies | A11105-01 | |
| Cell counter, automated | Coulter Counter | Z1 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| CD31-FITC | BD Pharmingen | 555445 | |
| CD144/VE-cadherin-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| FACS-Sorting device | Beckman Coulter | MoFlo XDP |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
- Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
- Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
- Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
- Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
- Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
- Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
