齧歯動物の槽注入カニューレ
Summary
ここチステルナ マグナ カニュレーション (CMc)、脳脊髄液 (CSF) にトレーサー、基板、シグナル分子を提供する低侵襲の方法を実行するプロトコルについて述べる。別の画像診断装置と組み合わせると、CMc が glymphatic システム、CSF のダイナミクス評価、様々 な化合物の脳全体で配信できます。
Abstract
チステルナ マグナ カニュレーション (CMc) は、頭蓋骨や脳実質への手術損傷なし脳脊髄液 (CSF) への直接アクセスを可能にする簡単な手順です。麻酔をかけられた齧歯動物、首の筋肉の鈍的切離による硬膜の露出槽 (CM) にカニューレを挿入ことができます。ベベル針またはホウケイ酸ガラス キャピラリーのいずれかで構成された、カニューレは、注射器にポリエチレン (PE) 管経由で添付されます。シリンジ ポンプを使用すると、分子を挿入できます制御率では、くも膜下腔と連続 CM に直接。くも膜下腔から我々 は間質液 (ISF) と溶質の交流が発生する貫通細動脈の周りの血管周囲スペースに対流に CSF フラックスを追跡できます。CMc または実行できますすぐに術後急性の注射のため慢性的な注入、麻酔で目を覚まし、以降のインジェクションの齧歯動物を自由に移動します。磁気共鳴画像 (MRI)、注入された分子の物理化学的特性によって、2 光子顕微鏡落射蛍光脳実質におけるトレーサー分布の定量が可能です。このように、様々 なイメージング技術と組み合わせて CMc は、glymphatic システムと髄液循環動態とその機能の評価のための強力なツールを提供しています。さらに、シグナル伝達分子と血液脳関門 (BBB) をそれ以外の場合はクロスができませんでした代謝基質の脳全体に高速配信するための導管として CMc を活用することができます。
Introduction
脳脊髄液 (CSF) は、心室システム全体と解剖学的に定義された領域を連続で、脳室と脳や脊髄をとりまく、くも膜下のスペースに沿って、中枢神経系 (CNS) を浴びる。CSF の主な機能の 1 つは代謝と脳実質からの溶質のクリアランスのためのルートを提供するためにです。クリアランスは、最近発見された glymphatic システム1、末梢のリンパ系にアナログ脳を介して促進されます。ここで、我々 説明し、チステルナ マグナ カニュレーション (CMc) 低侵襲法 CSF 中に分子の直接配信します。CMc は、glymphatic 関数を勉強するため重要なメソッドです。さらに、CMc は、髄液循環動態の研究と血管周囲のスペースに沿って、脳実質に非血液脳関門 (BBB) を透過性分子の脳全体に高速配信するためにも適用できます。
CMc 槽 (CM) の脳脊髄液で満たされた空間に標識トレーサー分子や薬を提供する中枢神経系を介して髄液循環運動動態の生理学的原則を悪用します。分子は、cm 分子は paravascular スペース1を介して脳実質に CSF 一括流れによってそれから運ばれる環椎後頭骨硬膜膜屋根に注入カニューレによって挿入されます。CMc によって挿入されたトレーサーまたはコントラストのエージェントにより CSF の動きと glymphatic 流入の評価、脳実質が入力された分子の強度レベルを定量化することで脳脊髄液の動きに追従します。CMc は、落射蛍光、2 光子の顕微鏡検査、磁気共鳴画像 (MRI) などさまざまなイメージング技術と互換性が。また、この評価をすることができます体内または体外で実行します。重要なは、CMc は、麻酔下でまたは自然な睡眠中にだけでなく、目を覚まし、自由に移動する動物の glymphatic システムの可視化のためことができます。
CMc 手法が CSF における流体力学のさまざまな側面を研究することが出来、glymphatic システムを学ぶために特に有用であると証明しました。Glymphatic 活動は終足血管折り返しアストロ サイトの膜に繋留するアクアポリン 4 (アクアポリン 4) 水路を介して動脈領域から脳脊髄液の対流をドライブします。対流の流れにより、髄液と脳実質内の間質液 (ISF) のインターチェンジ。CSF/ISF 代謝廃棄物や溶質を含むが静脈スペース2,3を介して脳実質から削除されます。最終的には、CSF/ISF 最近記述されていた硬膜リンパ管4,5を介して周囲に達する。Glymphatic システムは、アミロイド β2など有害な廃棄物代謝物質のクリアランスのため重要な示されています。さらに、glymphatic のクリアランスは加齢で6、外傷性脳傷害7後、糖尿病8 、9アルツハイマー病の動物モデルにおける障害者です。特に、glymphatic の活動は状態に依存しない、睡眠や覚醒1と比較すると麻酔中に有意に高い活性を示すです。確かに、若い麻酔下の動物は、最高の glymphatic 活動を展示します。したがって、健康と病気におけるその役割を勉強するとき、glymphatic 活動の実験の定量化は重要です。
いくつかの研究は、髄液循環動態と脳実質内に間質液 (ISF) とその交流に対処しています。ただし、標識分子を配信する方法、むしろ侵略的、脳実質の損傷、頭蓋内の圧力 (ICP) の変更をトリガー (を参照してください10を確認)。いくつかの例が脳や頭蓋骨に穴の開頭術やぎざぎざの掘削を伴うクモ膜注射。ICP、glymphatic 関数2をこうして中断することを変更するこれらの手順を示されています。また、このような侵襲的方法アストログリオーシスを誘発して脳実質損傷領域とその周辺11,12アクアポリン 4 免疫反応性を高めます。アストロ サイトとアクアポリン 4 は glymphatic システムの重要な要素である、CMc、その研究で選択の方法です。CMc より侵襲的処置と比較しての主な利点は、そのまま頭蓋骨と脳実質、ICP の変化とアストログリオーシス、それぞれ回避のメンテナンスです。したがって、glymphatic システムだけでなく、ダイナミクスを研究する可能性の広い範囲との恒常性だけでなく、神経疾患の動物モデルにおける流れのメカニズムのさまざまなイメージング ツールと組み合わせて内の CMc を開きます。
チステルナ マグナ カニュレーション (CMc) プロシージャは、脳脊髄液 (CSF) への直接アクセスをできます。異なる分子 (例えば蛍光トレーサー、MRI 造影剤) を注入することにより実験者は CSF コンパートメント内の動きを追跡し、glymphatic システムのアクティビティを評価することがことができます。次のプロトコルでは、注射、手術と動物が後で注入の手術から回復するカニューレの慢性注入直後のため、両方急性 CMc について説明します。急性および慢性の移植の最も重要な違いは、慢性的な注入が覚醒マウス glymphatic 活動の研究のためにできることです。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 はチステルナ マグナ カニュレーション (CMc)、CSF のコンパートメントに標識分子を配布する簡単な方法を提供するための詳細な手順を説明するプロトコルを提案しました。CMc では、髄液循環動態、体内と体外では、異なる画像モダリティや組織を使用しての両方の後続の可視化ことができます。
CMc 技術の主な利点の 1 つは、開頭して脳を公開するこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NINDS/NIH (m. n.) ノボ ノルディスク財団と国立研究所の神経疾患や脳卒中、によって支えられました。A.L.R.X. と S.H R ポスドク親睦とルンドベック財団から博士課程奨学金の受取人は、それぞれ。
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
