放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

1. 楽器、文化、メディア、ソリューション、およびシャーレ 50 mL のビーカーにオートクレーブつまようじは、無菌を保つためにアルミ箔で覆われています。 されるすべての乾燥品を滅菌するオートクレーブ (ヒント、棒、ガラス、等) を使用します。注: 注意!使用されるオートクレーブ モデルのすべての安全指示に従ってください。オートクレーブは、爆発や蒸気、熱、材料、およびメディアとの接触から火傷の危険をもたらします。オートクレーブの安全のため「オートクレーブの適切な使用」34を表示します。 文化を育てるに寒天 (マンニトール大豆小麦粉 (SFM))14 MS を準備します。 5 g の大豆小麦粉と寒天の 5 g を 1 L フラスコに追加します。 250 mL の水道水にマンニトールの 5 g を溶かし、大豆粉と寒天を含むフラスコに分注します。 121 ° c、15 psi、少なくとも 30 分間泡プラグ アンド フラスコとオートクレーブのオープニングに箔を追加します。注意: この媒体以上の簡単に沸騰します。少なくとも 4 回 MS 寒天培地をオートクレーブに入れることの実際の量を保持することができますフラスコを使用します。標準的な圧力鍋は、同様な安全配慮のオートクレーブの代わりに使用できます。また、オートクレーブへのアクセスが可能な35,36ではない場合、メディアや材料を滅菌する電子レンジを使用する可能性があります。高校教師ローカル大学やオートクレーブの供給にアクセスする大学と協力することも。 クールなメディアまでを処理するために十分に快適。50 ° C 以下の温度で寒天が固化するので長時間それを冷却しないように注意してください。 各ペトリ皿の底が約半分になるまで滅菌シャーレにフラスコから MS 寒天を注ぐフル (約 25 mL の培地シャーレあたり)。寒天を使用する前に固化することができます。必要になるまで室温でビニール袋に寒天を格納します。注: メディアで抗生物質が必要な場合に特に寒天版を冷蔵庫で保存される場合も。 2 連勝放線菌伝搬用板 MS 領域などの標準的なメソッドを使用して単一のコロニーを寒天上に連勝放線菌菌株は、サンダース、2012年37に示すように、メソッドを連勝します。注: 接種ループまたは生殖不能のつまようじを使用する可能性があります。(省略可能) その他のメディアが使われています R2YE や最小媒体14などの放線菌種。 30 ° C でプレートを孵化させなさい 単一コロニーのすべての 4-6 日を選択することにより、プレートを restreak します。植民地時代がランダムな突然変異しがちになります。 3. 細菌ストレージのグリセロール菌糸を作成します。 注: 菌糸株は、胞子形成を完了することができる他の発達変異体とbld株whiを含むすべての放線菌の菌株について作成できます。 200-500 μ L 滅菌木製だぼのアプリケーターを使用して 20% のグリセロールの 15-20 の植民地を漬け込みます。 マイクロ ピペットまたは無菌転送ピペットを使用して 1.5 mL 冷凍庫培養管にやせるコロニーのスラリーを転送します。注: マイクロ ピペット使用の基本は取り上げません38。 最終的なボリュームに十分な 20% グリセロールを追加 1 mL と軽く混ぜます。-80 ° C で試料を保存します。注: 注意!使用低温安全手袋、極端な寒さとの接触から皮膚を保護するために実験用の上着。また、長期貯蔵時間の潜在的な削減と-20 ° C のフリーザーを使用可能性があります。過剰な凍結と融解性を拡張するため避けてください。 4. 株の胞子グリセロールを作成する胞子形成が可能 注: 胞子株式は長期的な存続のために望ましいがのみ胞子形成を完了することができる系統の実現可能な。 成長37の合流芝生を取得する寒天 (ステップ 3.1) から漬け材料の 100 μ L を広めます。注意: 拡散めっきはサンダース37に表示 (変更: ターン テーブルは必要ありません。)。プレートをオンできます片手で穏やかに来たり、スプレッダーを移動する他の手を使用している間動き寒天媒体を経由。 ピペット 100 μ L の MS 寒天平板の中心にやせる菌糸体。 ガラスや金属の部分的に 70% のエタノールに水没し、エタノールの蒸発を促進するブンゼン バーナー火炎の中をゆっくり一度拡散機を渡すことによってツールを拡散を滅菌します。注意: エタノールは引火性の高いです。エタノールに燃えるようなスプレッダーを配置したり、エタノール エタノール皿に落下するのフレイミング ドロップを許可しないでください。また、エタノールや炎を必要としないプレートに細菌を広げる使い捨て滅菌綿棒を使用します。 MS 寒天バックを使用している間、片方の手でプレートし、前後の滅菌スプレッダーとプレートを接種する動きは電源を入れます。 歪みがよく sporulated まで 30 ° C で 5 ~ 7 日間インキュベートします。注: インキュベーション時間は、種や系統によって異なります。 滅菌生理食塩水 2 mL を追加 (0.8 %nacl) 胞子形成を経た放線菌細胞の合流の芝生の中心に。 芝生のエッジに向かって移動ループ (または綿棒) をゆっくりと接種滅菌菌糸体の表面をやさしくなでることで胞子を収穫します。 15 mL の円錐管に胞子をピペットで移しなさい、生理食塩水を含みます。個々 のセルに胞子の鎖を断ち切るに、積極的に渦。 常温約 2,500 x gで 5 分間遠心します。 上澄みをピペットで移しなさいと破棄。残りの液体の少量の積極的な渦攪拌による胞子ペレットを分散させます。 20% のグリセロールの 1 mL のピペットで上下にソリューションを描画することによって胞子を再懸濁します。 冷凍庫にある、1.5 mL のチューブにグリセロール胞子株式を転送します。-80 ° C でストア注意: 使用低温安全手袋、極端な寒さとの接触から皮膚を保護するために実験用の上着。また、長期貯蔵時間性の潜在的な削減と-20 ° C のフリーザーを使用可能性があります。過剰な凍結と融解性を拡張するため避けてください。 5. 突然変異誘発を実行します。 変異導入で参照している目的の結果に基づくし、Baltz、2016年39によって最近確認を実行します。注: いくつかの表現型解析実験には変異原性, 環境から新しい種を識別するために意図などは不要です。ランダム変異導入法には、トランスポゾン8,9,10、11,12,13、紫外線照射、または化学物質14の使用が含まれます。サイト指示された突然変異誘発15,16,17,18,19,20技術を使用して、特定のポイント突然変異、削除を作成できますか他のタイプの突然変異。 6 を比較し、視覚的な外観を記録 ステップ 2 のようにすべての株をストリー キングした後は野生型の親株に比べて各変異体のコロニー形態の注意してください。S の改変やS の venezuelae、 放線菌の新種を特性評価する際など、よく研究の種の新しい隔離集団を比較します。基本的な形は、植民地の表面などの特性 (図 1) に注意してください (ファジィ、ハゲ、しわなど)、不透明度、昇格、および色素沈着 (栄養菌糸、菌糸、および/または周囲の媒体を区別)。 ラベルの MS 寒天プレートとストリーク野生タイプおよび突然変異体系統くさびパターン (図 1)。ひずみが交差汚染を避けるために別の歪みを触れないように注意します。日付と時刻系統板に縞になることに注意してください。30 ° C で版を孵化させなさい 色やホワイト ペーパー バック グラウンドを均質に成長したシャーレを配置します。ストリー キングの最初のプレートから紙緊張の名前、日付、培養温度と時間を書いてください。後者の情報の混乱を最小限になるように用紙の背景に書かれたプレートのデジタル画像を取る。注: 書き込みできるからトリミング写真後で図の準備のため使用する場合は。 位相差顕微鏡を実行します。 70% エタノールで洗浄し、エタノールを蒸発するブンゼン バーナー炎を通過し、ピンセットを滅菌します。冷却することができます。 70% エタノールで洗浄し、滅菌シャーレに乾燥させる coverslips を滅菌します。 検査されるため細菌の増殖の coverslip リフトを準備します。 滅菌ピンセットで滅菌 coverslip をピックアップし、MS 寒天版の細菌の増殖は密、coverslip を配置します。カバーガラスの背中に軽く押しますピンセットで細菌の胞子と菌糸の十分な転送を確実に。 プレートから coverslip をピックアップし、セルの材料が付いている側面に取付のために水の準備 50% のグリセロールの 15 μ L ドロップで顕微鏡スライドの表面に向かって直面しているように配置。スライドに 45 ° の角度で、coverslip を配置することによって気泡を削減し、50% のグリセロールに落ちること。 (省略可能)クリアのシールはスライドの保存のマニキュアします。 位相差顕微鏡によるフレーリッヒ ・40さまざまな時間間隔でライフ サイクルの中に説明されているように実行します。注: 繰り返しイメージングは、詳細な分析と開発の遅延を検出する能力。精度と再現性を確保するため観測しない独立してを繰り返します。 顕微鏡ステージに準備されたスライドを配置し、カバー スリップの中心に液浸オイルの滴を追加します。100 X 相の目的で配置し、適切な「一致する」位相設定にコンデンサー砲塔を設定を回転させます。対物レンズは石油と接触が微調整ノブのみを使用してイメージの焦点を当てます。 突然変異系統と野生のタイプ、フォーム胞子、胞子のサイズと形状 (図 2参照) の胞子の全体的な数など顕著なと一貫性のある違いを識別するいくつかのフィールドの表示を確認します。注: は、位相差顕微鏡の代わりに、差動干渉の対照 (DIC) 顕微鏡40明視野顕微鏡41, クリスタル バイオレット染色などで簡単な染色技術を使用します。 8 蛍光顕微鏡を実行します。 ピンセットを滅菌するには、70% エタノールで洗浄し、ブンゼン バーナーの炎の中を実行します。 滅菌ピンセットや場所 MS 寒天版の細菌の増殖は明らかに滅菌 coverslip を拾います。細菌の胞子と空中フィラメントの十分な転送を確実にピンセットで、カバーガラスの背中をそっとさわってください。 プレートから coverslip をピックアップし、セルの材料が付いている側面を厚紙、カバーガラスの操作で容易にするために、向いているように配置。 冷たいメタノール (20 × 20 mm2 coverslip の ~ 300 μ L) coverslip の洪水、それは完全に空気乾燥できます。注意: メタノールは、変異原性です。皮膚との直接接触を避けます。 洗って、coverslip 3 回リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)42優しく調剤およびソリューションを削除してください。 100 μ g/ml Propidium ヨウ化物の 15 μ L を追加および/または (WGA FITC) かにラベル付き顕微鏡スライドに 50% グリセロール、10 μ g/mL 小麦胚芽凝集素鎖共役型します。注: Propidium ヨウ化汚れ DNA 赤 WGA FITC 緑細胞壁の汚れ、染色体 DNA の位置を検出します。 Coverslip 滴スライド ガラスに蛍光染色の上に下向きに反転します。(オプション) スライドの保存のための明確なマニキュアで封印します。 染料は光に敏感な暗く、薄暗い部屋での 15 分間インキュベートします。 位相コントラストまたはヨウ化 propidium (テキサス赤のフィルター設定、535/617 nm 励起/蛍光マキシマ) と FITC の落射蛍光励起キューブを搭載した DIC 顕微鏡を使用して 100 X 対物レンズの下でスライドを観察 (FITC フィルター設定または 490/525 nm励起/蛍光マキシマ)。 ステージと粗・微動調整ノブを使用してフォーカスにスライドを配置します。 43を他の所で示すように、蛍光を観察します。 低蛍光強度44と胞子の識別するために助けることができる無料の画像解析ソフトウェア パッケージを使用します。