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Abstract
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Immunology and Infection

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Published: September 12, 2018
doi:
10.3791/57373
, , ,
1Department of Biology and Earth Science, Biochemistry and Molecular Biology Program,Otterbein University, 2Department of Biological Sciences,Duquesne University

Summary

Hier stellen wir Protokolle für Anfänger Forscher um Phänotypisierung für die pharmakologisch wichtigen bakteriellen Gattung Streptomyceszu initiieren.

Abstract

Streptomyceten sind filamentösen Bodenbakterien, Phylum Actinobacteria angehören, die findet man überall in der Welt und produzieren eine breite Palette von Antibiotika und anderen sekundären Pflanzenstoffen. Streptomyces Coelicolor ist ein gut-gekennzeichneten, nicht-pathogene Arten, die für eine Vielzahl von Analysen im Labor zugänglich ist. Die Phänotypisierung beschriebenen Methoden verwenden hier S. Coelicolor als ein Modell Streptomycete; die Methoden sind jedoch auf alle Mitglieder dieser großen Gattung sowie einige eng verwandten aktinomyceten anwendbar. Phänotypisierung ist notwendig, um neue Arten von Streptomyces identifiziert in der Umwelt zu charakterisieren, und es ist auch ein erster wichtiger Schritt bei der Charakterisierung neu isolierten mutierte Stämme von Streptomyces. Kenntnisse in Phänotypisierung ist wichtig für viele neue Forscher, die das Forschungsgebiet Streptomyces eingeben umfasst die Untersuchung der bakteriellen Entwicklung, Zellteilung, Chromosom Abtrennung und zweite Bote Signalisierung. Die jüngsten Crowdsourcing antibiotische Entdeckung durch die Isolierung der neuen Bodenmikroben hat einen erhöhten Bedarf an Training in Phänotypisierung für Instruktoren, die neu auf dem Gebiet von Streptomyces -Forschung und ihrer Hochschule oder High School Studenten geführt. Dieses Manuskript beschreibt Methoden für Bakterienstamm Verteilung, Lagerung und Charakterisierung durch visuelle und mikroskopische Untersuchung. Nach der Lektüre dieses Artikels sollten neue Forscher (Mikrobiologie Bildung Laboratorien und Bürger Wissenschaftler) möglicherweise manipulieren Streptomyces Stämme und visuelle Charakterisierung Experimente beginnen.

Introduction

Streptomyceten sind Gram-positive, filamentösen Bodenbakterien, die bekannt für ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten, einschließlich mehr als zwei Drittel der im Handel erhältlichen Antibiotika, sowie als Anti-Tumor, produzieren Anti-HIV- und Anti-Parasiten-Medikamente 1. S. Coelicolor ist das am meisten genetisch geprägten Mitglied der Gattung2,3 und ist die Art in die hier beschriebenen Methoden verwendet. S. Coelicolor hat einen komplexen Lebenszyklus, der mit Keimen von einem einzigen Spore beginnt voran, eine umfangreiche, verzweigten vegetativen Myzel, das in das Agar-Medium wächst. Im weiteren Verlauf des Lebenszyklus entstehen Antenne Filamente, die brechen die Oberflächenspannung des Mycels Substrat und gliedern sich schließlich in langen Ketten von Zellen, die letztlich in Reife, grau pigmentierte Sporen umgewandelt werden. Dispersion von dieser neu gebildeten Sporen bildet den Anfang der nächsten Lebenszyklus4.

Aufgrund seiner komplexen Muster der Differenzierung dient S. Coelicolor als ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der bakteriellen Entwicklung. In der Vergangenheit Mutationen produzieren unterschiedliche visuelle Phänotypen und Blöcke für zwei wichtige Phasen der Entwicklung führen. Die Bld (Kahl) Mutanten sind für Luftaufnahmen Myzel Bildung und Ergebnis in dem Mangel einer fuzzy Antenne Myzel vermitteln eine “bald” Kolonie aussehen gesperrt. Mutanten in Sporenbildung gehemmt und Reifung werden als Whi (weiß) Mutanten bezeichnet weil sie nicht in der Regel Wildtyp Ebenen der grauen Spore-Pigmente zu produzieren und die Antenne Myzel bleibt weiß. Andere interessanteren Mutanten sind in der antibiotischen Produktion, Zellteilung, Chromosom Abtrennung oder andere wichtige Prozesse4,5gehemmt.

Trotz der Entdeckung der vielen entwicklungsgenen in Streptomyces -Arten es gibt viele mehr geglaubt, um existieren basierend auf das Fehlen der Sättigung der mutierten Bildschirme. Unsere Laboratorien weiterhin identifizieren neue entwicklungsgenen mit einer Mini-Transposon-System, die wir aufgebaut haben. Neuartige mutierte Stämme isoliert in zufällige Mutagenese-Experimente mit unserem Transposon unterziehen phänotypische Screening um die mögliche Rolle von jeder neuen gen entdeckt6,7zu identifizieren. Die Methoden zur bakteriellen Phänotypisierung hier beschriebenen sind für Streptomyces Mutanten isoliert durch Transposon Mutagenese8,9,10,11,12relevant, 13 und andere zufällige Methoden, wie chemische und Ultraviolett (UV) Mutagenese14sowie die gerichtete Konstruktion von Mutationen wie gen-Deletionen mit Restriktionsenzymen15,16 oder CRISPR-Cas9 (gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt) Genom Bearbeitung Technologie17,18,19 und Punktmutationen20.

Während Antibiotika-Resistenzen bei Krankheitserregern zunehmend verbreitet wird, wird der Bedarf an neuen Antibiotika immer dringender21,22. Die “Initiative kleine Welt” (oder SWI) ist eine effektive Wissenschaft, Technik und Mathematik (STEM) lernen23 und Forschung Strategie24 zur Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen durch Crowdsourcing von College-Studenten und vieles mehr vor kurzem Schülerinnen und Schüler. Unterstützte Kurse Arbeit umfasst die Identifizierung neuer Bodenmikroben, die neuartige Antibiotika (http://www.smallworldinitiative.org) zu produzieren. Es wird vermutet, dass eine wichtige Quelle von unentdeckten Antibiotika weiterhin Streptomyces -Arten gefunden in einer Vielzahl von Boden und Wasser Lebensräume25,26,27,28, 29,31. Vor kurzem, haben unser Labor und die Arbeit der anderen entdeckt und charakterisiert Signalisierung Gene in Streptomyces -Arten, die Morphologie und Entwicklung, einschließlich der antibiotischen Produktion7,32zu regulieren, 33. Veränderungen in der Expression dieser Gene führen zu Änderungen in der Höhe und Zeitpunkt von Antibiotika produziert. Qualifizierte Phänotypisierung von neuen Arten und neuen Antibiotika produzierenden Mutanten werden weiterhin wichtig sein. Neue Lehrer und ihre Schüler maßgeblich auf dem Gebiet der Arzneimittelforschung werden, ist die Ausbildung in bakteriellen Phänotypisierung notwendig für den Erfolg dieser unerfahrene Personen. Darüber hinaus sind diese Experimente für High School Stamm oder Mikrobiologie Bildung Universitätslabors steuerbar. Sie repräsentieren eine Demonstration der mikrobiellen genetischen Grundlagen in ein Lehrlabor einstellen.

Protocol

1. bereiten Sie Instrumente, Kultur, Medien, Lösungen und Petrischalen Autoklaven Zahnstocher in ein 50 mL Becherglas abgedeckt mit Alufolie, steril zu halten. Alle Textilien, die zu sterilisieren (Tipps, Stöcke, Glaswaren, etc.) in einem Autoklaven verwendet.Hinweis: Vorsicht! Befolgen Sie alle Sicherheitshinweise für die Autoklaven-Modell verwendet. Autoklaven stellen ein Risiko für Explosionen und Verbrennungen durch Dampf und Kontakt mit heißen Oberflächen, Materialien und Medien. Aus Sicherheitsgründen Autoklaven zeigen Sie an “Korrekte Verwendung des Autoklaven”34 Bereiten Sie die MS Agar (Mannit Soja Mehl (SFM))14 Kulturen wachsen. 1 L Flasche 5 g Sojamehl und 5 g Agar-Agar hinzufügen. 5 g Mannit in 250 mL Wasser auflösen und in die Flasche mit dem Sojamehl und Agar zu verzichten. Fügen Sie ein Schaum Stecker und Folie, um die Öffnung der Flasche und Autoklaven bei 121 ° C, 15 Psi für mindestens 30 min.Achtung: Dieses Medium kocht leicht über. Verwenden Sie eine Flasche, die mindestens viermal das tatsächliche Volumen des MS-Agar wird autoklaviert aufnehmen kann. Ein standard Schnellkochtopf kann anstelle ein Autoklav mit Sicherheit ähnliches verwendet werden. Alternativ kann eine Mikrowelle verwendet werden, um Medien und Materialien zu sterilisieren, ist Zugang zu einem Autoklaven nicht möglich35,36. High-School-Lehrer können auch mit lokalen Hochschulen oder Universitäten autoklaviert liefert Zugang zu zusammenarbeiten möchten. Kalte Medien bis komfortabel genug, um zu behandeln. Achten Sie darauf, nicht zu lange kühlen weil Agar bei Temperaturen unter 50 ° C erstarrt. Sterile Petrischalen MS Agar aus der Flasche einfüllen, bis der Boden jeder Petrischale etwa die Hälfte ist voll (ca. 25 mL Medien pro Petrischale). Vor der Verwendung von Agarplatten erstarren lassen. Speichern Sie Agarplatten in einem Plastikbeutel bei Raumtemperatur bis benötigt.Hinweis: Agarplatten können auch in einen Kühlschrank gelagert werden, vor allem, wenn Antibiotika in den Medien benötigt werden. 2. Streak Streptomyces auf Teller für die Vermehrung Streak Streptomyces Stämme auf MS Agarplatten in einzelnen Kolonien verwenden eine standard-Methode, wie z. B. den Quadranten Streifen Methode wie in Sanders, 201237gezeigt.Hinweis: Eine Impfkeimen Schleife oder sterilen Zahnstocher verwendet werden können. Optional: Andere Medien werden häufig für Streptomyces -Arten, wie R2YE und minimale Medien14verwendet. Platten bei 30 ° c inkubieren Restreak Platten durch die Auswahl einer einzigen Kolonie alle 4 – 6 Tage. Als Kolonien im Alter werden sie anfällig für zufällige Mutation. 3. Erstellen Sie Glycerin Myzel Bestände für bakterielle Lagerung Hinweis: Myzel Aktien können erstellt werden, für alle Streptomyces Stämme, einschließlich Whi Bld Stämme und andere Entwicklungsstörungen Mutanten, die Sporenbildung abschließen können. 15 – 20 Kolonien in 200 – 500 µL 20 % Glycerin mit einer sterilen Holzdübel Applikator mazeriert. Übertragen Sie der Brei aus eingelegten Kolonien auf 1,5 mL Gefrierschrank Kultur Rohr, mit einer Mikropipette oder sterilen transferpipette.Hinweis: Die Grundlagen der Mikropipette Nutzung fallen anderswo38. Fügen Sie genug 20 % Glycerin machen das Endvolumen 1 mL und vorsichtig mischen. Shop-Proben bei-80 ° C.Hinweis: Vorsicht! Kryo-Sicherheit Handschuhe tragen und einen Laborkittel Haut vor Kontakt mit extremer Kälte zu schützen. Alternativ kann ein-20 ° C-Gefrierschrank mit möglichen Rückgang der langfristigen Lagerzeit verwendet werden. Vermeiden Sie übermäßige Einfrieren und Auftauen um Rentabilität zu verlängern. 4. Erstellen Sie Glycerin Spore Bestände für Stämme in der Lage, Sporenbildung Hinweis: Spore Bestände sind vorzugsweise für langfristige Rentabilität aber nur machbar für Stämme, die Sporenbildung zu vollenden können. Verteilen Sie 100 µL des eingelegten Materials (aus Schritt 3.1) auf einer nährbodenplatte konfluierende Rasen Wachstum37zu erhalten.Hinweis: Ausbreitung Beschichtung zeigt sich in Sanders37 (Änderung: eine Drehscheibe ist nicht erforderlich.). Die Platte mit einer Hand drehbar während mit der anderen Hand den Streuer in einem sanften hin und her bewegen Bewegung über die Agar-Medien. Pipettieren 100 µL der eingelegten Myzel in die Mitte eines MS-Agar-Platte. Sterilisieren Sie ein Glas oder Metall Tool durch teilweise Eintauchen in 70 % igem Ethanol und übergeben den Streuer einmal langsam durch einen Bunsenbrenner Flamme zu beschleunigen die Verdunstung des Ethanols zu verbreiten.Achtung: Ethanol ist leicht entzündlich. Legen Sie den flammenden Streuer in Ethanol nicht oder erlauben Sie die brennenden Tropfen von Ethanol in der Ethanol-Schale fallen. Alternativ verwenden Sie eine Einweg-sterilen Wattetupfer, um die Bakterien auf der Platte verteilt, keine Ethanol- oder Flamme erfordert. Biegen Sie die MS-Agar Platte mit einer Hand, während mit einer Rückseite und her Bewegung die Platte mit der sterilen Streuer zu impfen. 5 – 7 Tage bei 30 ° C inkubieren Sie, bis der Stamm gut sporulated ist.Hinweis: Die Inkubationszeiten variiert je nach Art und Sorte. Fügen Sie 2 mL steriler Kochsalzlösung (0,8 % NaCl) in die Mitte eines konfluierende Rasens von Streptomyces -Zellen, die Sporenbildung durchgemacht hat. Ernten Sie Sporen durch leichtes reiben die Oberfläche des Mycels mit einem sterilen impfen Schleife (oder ein Wattestäbchen), langsam bewegten gegen den Rand des Rasens. Pipettieren der saline mit Sporen in einem 15 mL konische Röhrchen. Vortex kräftig zu Spore Ketten in einzelne Zellen zu sprengen. Bei Raumtemperatur für 5 min bei ca. 2.500 X gZentrifugieren. Pipettieren der überstand und entsorgen. Die Spore-Pellet durch kräftige Wirbel Agitation in der kleinen Menge der verbleibenden Flüssigkeit zu zerstreuen. Aufzuwirbeln Sie die Sporen in 1 mL 20 % Glycerin durch zeichnen die Lösung oben und unten mit einer Pipette. Übertragen Sie die Glycerin-Spore-Aktie auf ein 1,5 mL Gefrierschrank Rohr. Shop bei-80 ° C.Achtung: Kryo-Sicherheit Handschuhe tragen und einen Laborkittel Haut vor Kontakt mit extremer Kälte zu schützen. Alternativ kann ein-20 ° C-Gefrierschrank mit möglichen Rückgang der Rentabilität langfristig Lagerzeit verwendet werden. Vermeiden Sie übermäßige Einfrieren und Auftauen um Rentabilität zu verlängern. 5. führen Sie Mutagenese Führen Sie Mutagenese anhand der gewünschten Ergebnisse wie in der Einführung verwiesen und vor kurzem von Baltz, 201639überprüft.Hinweis: Einige Phänotypisierung Experimente benötigen keine Mutagenese, wie die Absicht, neue Arten aus der Umwelt zu identifizieren. Methoden der zufällige Mutagenese umfassen die Verwendung von ein Transposon8,9,10,11,12,13, UV-Strahlung oder Chemikalien14. Site-verwiesene Mutagenese15,16,17,18,19,20 Techniken können verwendet werden, um spezifische Punktmutationen, Deletionen, erstellen oder andere Arten von Mutationen. 6. vergleichen Sie und zeichnen Sie das visuelle Erscheinungsbild Beachten Sie Kolonie Morphologie für jede Mutante im Vergleich zu Wildtyp Elternstamm nach Streifen alle Stämme wie in Schritt 2. Vergleichen Sie das neue Isolat, dass eine gut untersuchten Arten, wie S. Coelicolor oder S. Venezuelae, wenn neue Streptomyces -Arten zu charakterisieren. Beachten Sie die Eigenschaften (Abbildung 1) wie Grundform, Oberfläche der Kolonie (fuzzy, Kahl, Faltig, etc.), Deckkraft, Höhen- und Pigmentierung (unterscheiden zwischen vegetativen Myzel, Antenne Myzel und/oder umgebende Medium). Beschriften Sie eine MS-Agar Platte und Streak Wildtyp und Mutanten Stämme in Keil Muster (Abbildung 1). Es ist darauf zu achten, dass keine Belastung eine andere Belastung berührt um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Beachten Sie das Datum und die Uhrzeit, die Stämme auf den Teller durchzogen sind. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C. Ort gewachsen Petrischalen auf farbigen oder weißen Papier Hintergrund zu homogenisieren. Schreiben Sie auf Papier der Stamm-Name, Datum, Inkubationstemperatur und Zeit von der ersten Platte Streifen. Nehmen Sie digitale Bilder der Platte mit den letzten Informationen auf dem Papierhintergrund geschrieben, so dass Verwirrung minimiert wird.Hinweis: Das Schreiben kann beschnitten werden aus der Fotografie zu einem späteren Zeitpunkt soll es für Abbildung Vorbereitung verwendet werden. 7. führen Sie Phasenkontrast-Mikroskopie Sterilisieren Sie Pinzette durch Waschen in 70 % igem Ethanol und dann durch einen Bunsenbrenner Flamme das Äthanol verdunsten. Abkühlen lassen. Sterilisieren Sie Deckgläsern, indem Sie in 70 % igem Ethanol zu waschen und dann in eine sterile Petrischale trocknen lassen. Bereiten Sie einen Deckglas Aufzug des Bakterienwachstums untersucht werden. Eine sterile Deckglas mit einer sterilen Pinzette holen Sie ab und das Deckglas auf einer nährbodenplatte MS wo ist Bakterienwachstum dicht. Drücken Sie auf der Rückseite des Deckglases vorsichtig mit einer Pinzette um ausreichend Transfer von Bakteriensporen und Antenne Myzel sicherzustellen. Das Deckglas aus der Platte holen Sie und platzieren Sie, so dass die Seite mit das Zellmaterial in Richtung der Oberfläche einen Objektträger mit einem 15 µL Tropfen 50 % Glycerin im Wasser für die Montage vorbereitet zeigt. Reduzieren Sie Luftblasen, indem man das Deckglas in einem 45°-Winkel zur Folie und lassen Sie es auf 50 % Glycerin. (Optional) Dichtung mit klaren Nagellack für die Erhaltung der Folie. Durchführen Sie Phasenkontrast-Mikroskopie wie in verschiedenen Zeitabständen während die Lebenszyklen von fröhlich40 beschrieben.Hinweis: Wiederholte Bildgebung ermöglicht eine umfassendere Analyse und die Fähigkeit zu Verzögerungen in der Entwicklung zu erkennen. Wiederholen Sie selbstständig die Beobachtungen, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Legen Sie die vorbereitete Folie auf den Mikroskoptisch und Tropfen Sie einen Immersionsöl auf der Mitte des Deckglases. Drehen Sie die 100 X Phase Ziel in platzieren, und legen den Kondensator-Turm auf die richtige Phaseneinstellung für “passende. Das Bild mit nur der Feinjustierung Regler einmal die Objektivlinse in Kontakt mit dem Öl zu konzentrieren. Untersuchen Sie verschiedene Gesichtsfelder zu erkennen, deutliche und konsistente Unterschiede zwischen mutierte Stämme und dem Wildtyp, wie die Fähigkeit, Sporen, Spore Größe und Form und Zahl der Sporen (siehe Abbildung 2).Hinweis: Alternativen zur Phasenkontrast-Mikroskopie sind differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie40 und einfache befleckenden Techniken, um mit Hellfeld Mikroskope41, wie Kristallviolett Verfärbungen. 8. führen Sie die Fluoreszenz-Mikroskopie Pinzette durch Waschen in 70 % igem Ethanol und laufen dann durch einen Bunsenbrenner-Flamme zu sterilisieren. Holen Sie eine sterile Deckglas mit sterilen Pinzette und Platz auf einer MS nährbodenplatte wo Bakterienwachstum offensichtlich ist. Tippen Sie auf die zurück das Deckglas vorsichtig mit der Pinzette um ausreichend Transfer von Bakteriensporen und Antenne Filamente zu gewährleisten. Das Deckglas aus der Platte holen Sie ab und platzieren Sie, so dass die Seite mit dem Zellmaterial, auf Karton zur einfachen Manipulation von dem Deckglas gegenübersteht. Überschwemmen Sie das Deckglas mit eiskalten Methanol (~ 300 µL für ein 20 x 20 mm2 Deckglas) und lassen Sie komplett Lufttrocknen.Achtung: Methanol ist ein Mutagen. Vermeiden Sie direkten Hautkontakt. Waschen Sie das Deckglas dreimal Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)42 vorsichtig Dosieren und entfernen die Lösung. Fügen Sie 15 µL von 100 μg/ml Propidium Jodid und/oder 10 μg/mL Weizen-Keim-Agglutinin konjugiert zu Fluorescein erfolgt (WGA-FITC) in 50 % Glycerin gemacht, um einen beschrifteten Objektträger.Hinweis: Propidium Jodid DNA Flecken rot, chromosomale DNA Lage zu erkennen, während WGA-FITC Zellwand grüne Flecken. Deckglas Gesicht nach unten auf den Tropfen fluoreszierende Fleck auf den Objektträger zu invertieren. (Optional) mit klaren Nagellack für die Erhaltung der Folie abdichten.  Da die Farbstoffe lichtempfindlich sind, 15 Minuten in einem abgedunkelten oder schwach beleuchteten Raum inkubieren. Beobachten Sie die Folien unter ein 100 X Objektiv mit einem Phasen-Kontrast oder DIC Mikroskop ausgestattet mit Epifluoreszenz Erregung Würfel für Propidium Jodid (“Texas Red” Filter setzen oder 535/617 nm Anregung/Emission Maxima) und FITC (FITC filter Set oder 490/525 nm Anregung/Emission Maxima). Legen Sie die Folie, auf der Bühne und Fokus mit den groben und feinen Einstellknöpfen. Beobachten Sie die Fluoreszenz wie anderswo43gezeigt. Verwenden Sie ein Kostenloses Bild Analyse-Software-Paket, die bei der Identifizierung von Sporen mit niedrigeren Fluoreszenz Intensität44helfen können.

Representative Results

Anfängliche Phänotypisierung Experimente sind notwendig für die Charakterisierung von neuen Arten und Stämme und können als ein kostenloses Ansatz bei der Phylogenetik und DNA-DNA-Hybridisierung-Experimente, die verwendet werden, für die Charakterisierung von neuen Arten verwendet werden. Streptomyces Mutanten aus zufälligen Mutagenese Methoden wie Chemie, UV, oder Transposon Mutagenese sind in der Regel durch direkten, visuellen Bildschirme auf Agarplatten identifiziert. Kolonien von Streptomyces werden auf Veränderungen im Phänotyp im Vergleich zu Wildtyp, elterliche Belastung untersucht. Zum Beispiel eine leichtere farbigen Luftaufnahme Myzel deutet auf ein geringeres Maß an grauen Pigment, verursacht durch einen Defekt in Sporenbildung, oder das Fehlen von unscharf aussehen ist bezeichnend für einen Block in Antenne Myzel-Formation (Abbildung 1). Viele verschiedenen produzieren pigmentierten Antibiotika im vegetativen Myzel oder umliegenden Agar. S. Coelicolor produziert zwei pigmentierte Antibiotika sowie zwei nicht pigmentiert sind. Actinorhodin ist ein blau-pigmentiert Antibiotikum und Undecylprodigiosin ist ein rot pigmentiert Antibiotika-45. Stämme, die erste visuelle Kolonie Bildschirme durchlaufen haben sind dann Streifen für die einzelnen Kolonien propagierten. Stämme werden nach visuellen Identifikation potentiell interessante Mutanten mikroskopische Untersuchung unterzogen. Phasenkontrast-Mikroskopie eignet sich besonders zur Untersuchung von Streptomyces Mutanten für Entwicklungsschäden, unter Verwendung den Wildtyp Stamm als ein Steuerelement (Abbildung 2). Wildtyp S. Coelicolor Kolonien produzieren in der Regel eine Antenne Myzel von etwa zwei Tagen Wachstum bei 30 ° C auf MS Agar und lange Ketten von Sporen durch drei Tage des Wachstums. Der Lebenszyklus wird etwas langsamer oder schneller auf andere Arten von Medien Fortschritt. Es ist zwingend notwendig, dass die Mutanten unter der gleichen Wachstumsbedingungen als der Wildtyp analysiert werden, wenn Sie Rückschlüsse auf die Entwicklungsschäden und Verzögerungen zu zeichnen. Glatze Mutanten können Sporen nach längerem Wachstum auf Agar Medien produzieren. Eine Klasse von Mutanten, die als weiße Mutanten entweder für die Sporenbildung, verzögert werden können zeigen eine Reduktion in der Fülle von Sporen produziert, produzieren Sporen mit Form und/oder Größe Mängel oder einfach Produkte niedrigeren Ebenen der Reife, graue Spore Pigment46 . Anderen Mutanten untersucht so weit sein verzögert oder beschleunigt in der Life-Cycle-Progression wie die Mutanten, die für die Akkumulation von Signalmoleküle (z.B. zyklische di GMP47) betroffen. Einfach anschließt an die Lichtmikroskopie-Technik, die oben beschriebenen Fluoreszenz-Mikroskopie mit Propidium Jodid Fleck chromosomale DNA ausgedehnt und Gewebekulturen beschrifteten Weizenkeime Agglutinin, um die Zellwand der Sporenbildung Septen zu beflecken. Fehlt ein Chromosom Sporen werden frei von den roten Propidium Jodid Färbung, während die Sporen, die enthalten weniger DNA als übliche identifiziert werden kann, erscheint sie abgenommen haben (Abbildung 3) Färbung. Wheat Germ Agglutinin kann verwendet werden, um die Zellwand zu beflecken und Unterschiede in der Zellwand Muster (d.h. Zellteilung Mängel) Färbung beobachtet werden können. In Abbildung 4 der Wildtyp-Stamm von S. Venezuelae, eine Spezies, die vor kurzem als ein anderes Modell verwendet wird hat Streptomycete wegen seiner schneller Lebenszyklus und Fähigkeit, in flüssigem45, sporulate mit WGA-FITC aufzuklären befleckt worden Das Leiter-wie Array von Division Septen, die in der Regel früh während der Sporenbildung gesehen werden. Die anfängliche Phänotypisierung Strategien hier beschriebenen sollte dazu führen, dass die folgenden: 1) Identifizierung mutierte Stämme von Interesse für weitere Untersuchungen; (2) erworbenen Kenntnisse über die neu identifizierten Mutante und die mögliche Rolle des Gens, das mutiert worden ist; (3) die Formulierung einer anschließenden Reihe von experimentellen Schritte, die zur weiteren Klärung der Rolle des betreffenden Gens verwendet werden können. Im Falle einer neu entdeckten Streptomycete aus der Umgebung gewinnen die Forscher wissen über möglichen neuen Arten, die im Vergleich zu Arten von Streptomycesbereits gekennzeichnet. Abbildung 1: Foto von einer repräsentativen nährbodenplatte makroskopischen Kolonie Phänotypen von S. Coelicolordemonstrieren. Der Agarplatte zeigt die fuzzy, graue Optik des Mycels Antenne für Wildtyp S. Coelicolor Stamm MT1110 (WT) im Vergleich zu verschiedenen zufälligen Transposon Einfügung Mutanten mit Entwicklungsstörungen Phänotypen. Mutanten fehlen entweder eine Antenne Myzel [Kahl (Bld)] oder eine Antenne Myzel mit reduzierten Spore Pigmentierung [White (Whi)]. Transposon Mutanten wurden mit Mini-Tn5 für Einfügung Mutagenese6,7erzeugt. Die Stämme wurden auf MS-Agar für 5 Tage bei 30 ° c gewachsen. Petrischale Durchmesser 100 mm. Abbildung 2: Phasenkontrast-Aufnahmen zeigen einen Vertreter Antenne Filament für S. Coelicolor weißen Mutante Stämme mit zufälligen Transposon Einfügung Mutationen. (A) gezeigt ist eine repräsentative Wildtyp Antenne Filament, die synchron, regelmäßig verteilt Zellteilungen, produzieren gleichmäßig durchlaufen hat Form und Größe Sporen (MT1110). (B–F) Die restlichen Tafeln zeigen die sehr unterschiedlichen mikroskopische Phänotypen der verschiedenen weißen Mutanten, die per Zufallsprinzip Transposon Mutagenese isoliert wurden. Zentrale B zeigt eine Luftaufnahme Filament, die Sporenbildung nicht durchgemacht hat, aber stattdessen hat prall gefüllte Bereiche innerhalb der Heizfaden produziert. Lange Pfeile in C, Dund F zeigen ungewöhnlich große Sporen, die charakteristisch für Mutanten, MIC42, MIC43 und TH49. Der kurze Pfeil im Bedienfeld ” D ” gibt ein Beispiel für ein lysierten Spore-Fach. E zeigt die teilweise verengten kleinere Fächer, die typisch für die Spore-Ketten von Mutant TH10 produziert sind. Die Stämme wurden auf MS-Agar für 5 Tage bei 30 ° c gewachsen. Die Mutanten sind unabhängig von den in Abbildung 1dargestellten. Eine Wildtyp-Spore ist etwa 1,1 µm auf der Längsachse. Maßstabsleiste = 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Repräsentative mikrographen zeigt S. Coelicolor mutierte Chromosom Abtrennung Phänotypen. (A) A Diagramm Darstellung zeigt das typische Wildtyp, regelmäßig verteilt Färbung aussehen für eine Kette von Sporen (jede Spore enthält chromosomalen DNA) zum intermittierenden Färbung Muster für eine Mutante verglichen, die ein Chromosom zeigt Segregation ist defekt. (B) zeigt jedes Paar Platten der gleichen Spore Kette von Differential Interferenz Kontrast (DIC) Bild auf der linken Seite beobachtet und eine Propidium Jodid-gefärbten fluoreszenzbild wird auf der rechten Seite angezeigt. Der Wildtyp Phänotyp (a, b) ist im Vergleich zu zwei zufällige Transposon Einfügung Mutanten (c, d und e, f). Die Pfeile geben die Sporen frei von DNA. Die Stämme wurden auf MS-Agar für 5 Tage bei 30 ° c gewachsen. Die Mutanten gezeigt sind unabhängig von den in Abbildung 1 und Abbildung 2. Maßstabsleiste = 1 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Fluoreszenz Schliffbild S. Venezuelae Wildtyp Stamm mit WGA-FITC befleckt. (A) A Diagramm von einer Antenne Filament erscheint glatt mit keine Einbuchtungen und hat keine sichtbaren Anzeichen der Sporenbildung mit Phasenkontrast-Mikroskopie im Vergleich zu den Leiter-wie Array der Zellwand Färbung, die angibt, einem frühen Stadium der Sporenbildung in diesem gleichen Filament mit WGA-FITC unter Fluoreszenz-Mikroskopie begonnen. (B) Aufnahmen von Wildtyp S. Venezuelae. (ein) reibungslose Luftaufnahmen Filamente sind bei den Ketten der Sporen. (b) in das Myzel im Panel angezeigt, eine Antenne Glühfaden in einem frühen Stadium in der Entwicklung besitzt eine Strichleiter-wie Array der Zellwand Ablagerung. Pfeile zeigen die regelmäßig verteilt Bildung von Kreuz-Wände gebeizt von WGA-FITC, die synchron innerhalb einer einzigen Antenne Filament zu entwickeln, wie es Entwicklungsgeschichtlich verbundenen Sporenbildung erfährt. Der Stamm wuchs auf MYM (MAltose, Y-Osten-Extrakt, MAlt Extrakt) MYM Agar 38 h bei 30 ° C. Maßstabsleiste = 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Hier präsentieren wir Protokolle für den Beginn von Streptomyces Forscher um Studien zu initiieren, indem unter anderem die notwendigen Schritte zur Stämme zu propagieren und vorzubereiten Bestände für die langfristige Lagerung. Dann beschreiben wir die Protokolle für visuelle und mikroskopische Charakterisierung von Streptomyces Stämme. Einige typische erste Schritte in Phänotypisierung Entwicklungsstörungen Mutanten sind: 1) Sichtprüfung der Mutanten Kolonien im Vergleich zu Wildtyp-Kolonien auf Agar Medium; (2) Phasenkontrast-Mikroskopie; und 3) Fluoreszenz-Mikroskopie von sporogenes Antenne Hyphen. Basierend auf den Phänotyp in diesen drei Schritten angezeigt, kann eine Vielzahl von Techniken eingesetzt werden, um weiter den Phänotyp eines bestimmten Stammes zu erkennen.

Anfängliche Phänotypisierung Experimente sind häufig verwendet, um neue Arten zu charakterisieren, Mutanten von Interesse zu identifizieren, teilweise Mutanten zu charakterisieren und beginnen zu erkennen, die typische Rolle eines bestimmten Gens, basierend auf den Phänotyp einer identifizierten mutierte. Die hier beschriebenen Methoden wurden bereits eingesetzt, in der universitären Lehre Labors zu identifizieren und zu charakterisieren eine Vielzahl von Streptomyces Mutanten, einschließlich derjenigen mit defekten Zellteilung48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, Sporenbildung55,56, Antenne Myzel Bildung57,58, antibiotischen Produktion59, second Messenger Signalisierung47und Chromosom segregation 60. diese Techniken sind wichtige erste Schritte zur Bestimmung des Phänotyps der Mutanten im allgemeinen und zeigen eine große Menge von wichtigen Informationen über die Rolle der Gene von Interesse. Die Methoden können leicht auf andere Arten von Streptomyces verlängert werden und bereits verwendet wurden, um die Stämme von S. früh, S. Venezuelae, S. Krätzeund vielen anderen Streptomyceten beschreiben. Die hier beschriebenen Videoprotokolle sollen als eine wichtige Ressource für neue Forscher Eingabe Streptomyces Forschungsgebiete, wie z. B. im Bereich der Arzneimittelforschung dienen. Dazu gehören der neue Lehrer, die gegen die Antibiotika-Resistenz-Krise und die zahllosen neuen Bachelor-Student Forscher verbinden die Crowdsourcing-Bemühungen der kleinen Welt Initiative Erziehung tätig sind.

Die hier beschriebenen Techniken können College und High School Verwendung im Unterricht neben Forschungslabors, mit den Änderungen in der Video und Text beschrieben leicht angepasst. Studenten in einem ersten Jahr Mikroskopie-Modul an eine kleine liberale Kunsthochschule durften Streifen Stämme, digital fotografieren von Stämmen auf Agar Medien gewachsen und durchführen Phasen-Kontrast und Fluoreszenz-Mikroskopie, kulminierte in der Vorlage eine Portfolio von Multi-getäfelten Zahlen am Ende des Moduls 3 Woche, 15 h im Labor Arbeit darstellt. Ca. 160 Studenten im erste Studienjahr sorgten für die ersten Phänotypisierung von 320 Roman Transposon-Mutanten. Bachelor Forschungsstudenten an drei Hochschulen nahmen an der ersten Phänotypisierung von zusätzlichen Mutanten und die anschließende Charakterisierung vieler Stämme. Die umfassenden Daten in relativ kurzer Zeit, zeigen den Wert der hier beschriebenen Protokolle. Hunderte von zusätzlichen Mutanten wurden als Glycerin Myzel Bestände für zukünftige Charakterisierung gespeichert.

Im Anschluss an die erste Experimente hier beschrieben kann eine Vielzahl von Methoden eingesetzt werden, um die Qualität der Informationen im Zusammenhang mit Belastungen von Interesse zu verlängern. Wenn die Mutation nicht bekannt ist, sollte eine Genotypisierung-Methode eingesetzt werden, bestimmen die Art und/oder Ort der Mutation. Z. B. zufällige Transposon Mutagenese der Wildtyp Chromosom6,7,8,9,10,11,12,13 ergibt sich in Kolonien, die phänotypische Einstiegsbilder wie beschrieben oben unterzogen werden soll. Dann sollte die Position des das Transposon mit einer Technik wie inverse Polymerase Kettenreaktion (iPCR)61identifiziert werden. Bestimmung des Genotyps des neu entdeckten Mutanten ist ein wichtiger Schritt nach anfänglichen Charakterisierung.

Einige häufig verwendeten fortschrittliche Methoden für nachfolgende Phänotypisierung Analyse, die möglicherweise im Unterricht erwähnt oder durch weitere Forschung erforscht sind grünes fluoreszierendes Protein (GFP) tagging um Lokalisierung Muster für das Protein des Interesses festzustellen, Genexpressionsanalysen wie Real time quantitative PCR (qPCR) und global Gen Expressionsmuster von Wildtyp versus Mutante über RNA Sequenzierung (RNA-Seq). Phänotypisierung Fähigkeiten sind auch für die Ergänzung der genetischen Analyse erforderlich. In einem Experiment Ergänzung wird die Wildtyp Kopie eines Gens eingeführt, in einen mutierten Stamm zu bestimmen, ob das neu hinzugefügte Allel für den Verlust der Funktion des mutierten Allels kompensieren kann. Vergleicht man den Phänotyp der ergänzt Belastung derjenigen der ursprünglichen Mutant und der Elternzeit, ist Wildtyp Stamm erforderlich.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Otterbein University für Undergraduate Student Forschungsstipendien und Student Research Fund Awards GVK und SGK anerkennen; und das Otterbein Professor Gilbert E. Mills Memorial dotiert Sabbatical Programm Award und den Fachbereich Biologie und Geowissenschaften Fakultät für Wissenschaft und Forschung dotierte Auszeichnung für JAB. GVK und SGK erhielt Bert und Jane Horn ausgestattet Student Research Fund in den Wissenschaften. Die Autoren möchten auch dankbar anerkennen, dass Duquesne University Undergraduate Programm Forschungsstipendien für GVK und SGK finanziert. Ehemalige Juniata College Bachelor Forschungsstudenten, Ryan Johnson und Lindsey Draper trug die Mikroskopie-Bilder für die Abbildungen 2 und 3, bzw..

Materials

50% Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Immersion Oil (Type DF) Cragille  16482
Lens Paper Fisherbrand 11-995
Sterile Water GeneMate G-3250-1L
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
Toothpicks (flat) Target 081-22-1957
Pipette Tips (10 ml) GeneMate P-1240-10
Pipette Tips (200 ml) GeneMate P-1240-200Y
Pipette Tips (1250 ml) GeneMate P-1240-1250
Wooden Applicators 6'' Solon Care 070809
Cotton Swabs Fisherbrand 23-400-124
Soy Flour  Bob's Red Mill  1516C164
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-1KG
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG
Glycerol 100% VWR amresco life science  0854-1L
0.8% NaCl (Saline) Sigma-Aldrich SLBB9000V
1.2 mL freezer tube NEST 606101
Ultra low (-80°C) freezer SO-LOW U85-18
Cryo Safety Gloves Bel-Art H13201
Petri dishes  Sigma-Aldrich P5856-500EA
Cover slips #1.5 Thomas Scientific 64-0721
Slides Carolina 63-2010
Autoclave Tuttnauer 2540E
Phase-Contrast Microscope  Olympus BX40
Forceps Carolina Biological 624504
Bunsen Burner Carolina Biological 706706
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1L-R
PBS (phosphate buffer saline) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
WGA-FITC Biotium 29022-1
Clear nail polish OPI 22001009000
Image J NIH Free Software
100 mL beaker Pyrex USA 1000-T
1 L beaker Carolina Biological 721253
1 L flask Fisherbrand S63274
250 mL flask Pyrex USA 4980
100 mL graduated cylinder Carolina Biological 721788
500 mL graduated cylinder  Carolina Biological 721792
Stir Bar Fisher Scientific 22-271825
Centrifuge Eppendorf 5810R
Camera for Microscope Olympus DP72
Nitrile Examination Gloves (Med) Bio Excell 71011002
Vortex Mixer Carolina Biological 701077
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References

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Bennett, J. A., Kandell, G. V., Kirk, S. G., McCormick, J. R. Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants. J. Vis. Exp. (139), e57373, doi:10.3791/57373 (2018).
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