Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus
Summary
Se describe un protocolo simple y fácil para medir la mejora dependiente de anticuerpos de la infección por Zika virus suero convaleciente con partículas virales de Dengue virus reportero.
Abstract
Mejora dependiente de anticuerpos de la infección se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la patogenia viral de Dengue. Los análisis tradicionales que miden la capacidad de los anticuerpos o del suero para mejorar la infección en líneas celulares han confiado en usar salida viral en los medios de comunicación seguido por ensayos de placa para cuantificar la infección. Más recientemente, estos ensayos han examinado la infección del Dengue virus (DENV) en las líneas celulares usando los anticuerpos de fluorescencia marcados. Ambos estos métodos tienen limitaciones que restringen el uso generalizado de estas técnicas. Aquí, describimos un análisis simple en vitro con Dengue virus reportero partículas virales (RVPs) que expresan la proteína verde fluorescente y las células K562 a examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por DENV usando el suero que se obtiene de macaco de la India macacos 16 semanas después de la infección con el virus Zika (ZIKV). Esta técnica es confiable, implica la mínima manipulación de las células, no implica el uso de virus competentes de replicación directo y puede realizarse en un formato de alto rendimiento para obtener una lectura cuantitativa mediante citometría de flujo. Además, este análisis pueden ser adaptado fácilmente para examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de otras infecciones de flavivirus como el virus de la fiebre amarilla (YFV), virus de la encefalitis equina (JEEV), virus del Nilo Occidental (VNO) etc. donde RVPs están disponibles. La facilidad de establecer el ensayo, análisis de los datos y la interpretación de los resultados hacen altamente susceptibles a más valores de laboratorio.
Introduction
Mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección es un proceso por el que las respuestas de anticuerpos cruz-reactivos parcialmente inducidas por un serotipo de virus mejora la absorción de otro serotipo del virus, llevando a mayor replicación viral y viremia. ADE ha sido ampliamente documentado en las infecciones del virus (DENV) Dengue donde predominan cuatro serotipos principales. En un subgrupo de pacientes, ADE se asocia con la fiebre hemorrágica de Dengue (FHD). Recientemente hemos demostrado que la infección del virus (ZIKV) Zika inducido significativamente altos niveles de respuestas de anticuerpos cruz-reactivos de DENV que causaron ADE de DENV en vitro y probablemente contribuyeron a la mejora de la viremia DENV en vivo1 , 2. ensayos de mejora dependiente de anticuerpo son una herramienta valiosa para evaluar la capacidad de anticuerpos para mejorar la infección secundaria con virus relacionados y proporcionar información valiosa en la patogenesia de infecciones por flavivirus e informar a la desarrollo de vacunas.
El descrito aquí emplea DENV RVPs junto con las células K562 que son normalmente inadmisibles a la infección. RVPs son estructuralmente intacto replicación incompetente DENV partículas virales que codifican un replicón de sub-genomic proteína verde fluorescente (GFP) que se expresa después de una sola ronda de replicación3. Así, las células que se infectan con RVPs fluorescencia verde y pueden ser fácilmente detectadas mediante citometría de flujo o microscopia. Los RVPs utilizados en este ensayo se obtuvieron de fuentes comerciales. Sin embargo, se pueden generar contra otros virus y utilizado en el ensayo se describe en este manuscrito. Mientras tanto, las células K562 son una línea de células de leucemia FcγIII-receptor-expresión que se unen a la región Fc de los anticuerpos y se infectan en la presencia de neutralizar las concentraciones de anticuerpo4,5.
ADE los ensayos se han utilizado en estudios que investigaron los factores de riesgo para dengue grave y delinear los mecanismos de en vitro ADE6,7,8. El ensayo de ADE descrito aquí puede ser rápidamente y fácilmente usado para determinar la capacidad del suero para mejorar en vitro infección usando RVPs y flujo cytometry, en comparación con otros ensayos utilizados en la actualidad, que requieren ya sea la determinación de la formación de placa unidades (pfu) en células Vero o tinción de anticuerpos de la infección las células6,7,8,9,10,11, los cuales son desperdiciadores de tiempo y mano de obra intensivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flaviviruses DENV como ZIKV compartir evidencia significativa de homología en ambos sus proteínas estructurales y no estructurales que generan anticuerpos que cruz-reaccionan con otros13,14. Estas respuestas de anticuerpos cruz-reactivos se han demostrado para mejorar de la infección tanto en vivo como en vitro con un serotipo heterólogo u otros relacionados con flaviviruses1,2. El p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto descrito fue apoyado por fondos de la Universidad de servicios uniformados de Ciencias de la salud a JJM. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son los privados de los autores y no son ser interpretados como oficiales o refleja las opiniones del Departamento de defensa, la Universidad de servicios uniformados de Ciencias de la salud o cualquier otra agencia de los Estados Unidos Gobierno.
VGP realizó todos los experimentos y analiza los datos; JJM diseñado y supervisado el estudio; WGW y JJM escribieron el libro.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
