付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

1. ウェル プレートに薄層ポリアクリルアミドゲル (PA) ゲルの製造 過硫酸アンモニウム (APS) を 10 グラム/mL の最終的な集中を達成するために超高純度蒸留水に溶かしてください。因数とストア短期使用 (3 週間) のための 4 ° C でソリューション。注: 上記の解決策は、ゲル作製を事前に用意できます。 24 よく料理のガラスの活性化 室温でウェルあたり 2 M NaOH を 500 μ l 添加で 1 h 24 ウェル ガラス底板 13 mm 径井戸 (材料の表を参照) を孵化させなさい。 1 井戸を洗浄純水を x、500 μ L の 2% (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを追加 (材料の表を参照してください) それぞれ 95% エタノールに 5 分も。 水でもう一度 x 1 井戸を洗い、30 分すすぎ 1 井戸の各ウェルに 0.5% グルタルアルデヒドの 500 μ L を追加水 x ふた付き 60 ̊ C でそれらを乾燥し、。 図 1: 様々 な剛性の薄い 2 層蛍光ビーズに埋め込まれたポリアクリルアミド (PA) ゲル上に存在する宿主細胞の細菌感染試験。A.ガラス coverslips 化学ハイドロゲルの添付ファイルを有効にするのに変更されます。B. 3.6 μ PA の混合物はガラスの底で堆積しました。C. 混合物の重合を可能にする 12 mm 円形ガラス coverslip で覆われています。D. 針注射器で、coverslip が削除されます。E. 2.4 μ L マイクロ ビーズと PA ソリューションの下のレイヤーの上に追加され、円形ガラス基板を頂いた。F. 井戸のバッファーが追加され、coverslip が削除されます。G. 1 h における紫外光照射により殺菌します。H.、10 分は私の UV の下で配置されているゲルのスルホ SANPAH 含むソリューションが追加されます。ゲルをバッファーで洗浄してそれからコラーゲン i. Jで夜通し孵化します。ヒドロゲルは携帯メディアと平衡に達した。K。 ホスト細胞を播種。L.Lm 細菌がソリューションに追加され、遠心分離を介して感染を同期します。M. ソリューションの 1 h 後感染細菌が洗い流される、抗生物質を添加したメディアが追加されます。N. 4 h 感染後、蛍光を発する Lm (JAT985) が開始。O. HMEC 1 セルのマトリックスから切り離されます、ソリューションが流れ cytometry 測定を行うためのチューブに転送されます。日、試金の各ステップに必要な時間が示されていることに注意してください。この図は、Bastounis と・ テリオ59から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 ポリアクリルアミド ゲル作製注: 参照してください図 1. 40% ストック アクリルアミド溶液の 3-10% を含む水溶液を準備 (材料の表を参照) と 0.06 – 2% 0.6% 貯蔵 bis アクリルアミド液 (材料表を参照) 0.6 からまで可変剛性のゲルを製造するには70 kpa kPa。表 1を参照してください。 0.6 kPa ヒドロゲルの 0.045% ビス アクリルアミドと 3% アクリルアミドをミックスします。3 kPa ヒドロゲルの 0.074% ビス アクリルアミドと 5% アクリルアミドをミックスします。10 kPa ヒドロゲルの 0.075% ビス アクリルアミドと 10% アクリルアミドをミックスします。20 kPa ヒドロゲルの 0.195% ビス アクリルアミドと 8% アクリルアミドをミックスします。70 kPa ヒドロゲルの 0.45% ビス アクリルアミドと 10% アクリルアミドをミックスします。注: 望ましい PA ハイドロゲル剛性を達成するための詳細についてはさらに見つけることができます他の場所24,25,26,27。 各望ましいハイドロゲル剛性の 2 つの水溶液を準備します。準備するソリューション 1 ビーズ無料ソリューション 2 0.03 %0.1 μ m 径蛍光マイクロ ビーズ (材料の表を参照) を格納します。 ドガ ソリューション 1 と 15 分間の真空によって 2 ソリューションの重合を阻害する知られている酸素を除去するために。 重合開始を有効にするソリューション 1 に 10 グラム/mL の在庫 APS ソリューション、0.43% テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 0.6% を追加します。迅速に行動します。 24 よく料理の各ウェルのセンターにソリューション 1 の 3.6 μ L を追加 (その準備手順 1.2を参照してください)。 すぐに 12 mm 未処理円形 coverslips に井戸をカバーし、ソリューション 1 のそれは完全に重合して 20 分間座ってみましょう。 優しく、coverslips の除去を容易に、その先端に小さなフックを作成するために表面に注射針をタップします。注射針を使用して coverslips を持ち上げます。 10 グラム/mL の原液 APS の 0.6%、0.43% を追加 TEMED ソリューション 2」に。24 よく料理の各ウェルに 2.4 μ L の最初の層の上に混合物を入金します。 ソリューション 2 を 12 mm 円形ガラス coverslips にカバー、優しく下ピンセットのペアを使用して 2 番目の層の厚さを確保するため押しては最小限です。20 分間重合ソリューション 2 をしましょう。 各井戸に 50 mM HEPES pH 7.5 の 500 μ L を追加し、鉗子、注射針とガラス coverslips を削除します。 殺菌、コラーゲン ・ コーティング、ポリアクリルアミド ゲルの平衡 公開-UV ティッシュ文化フードの 1 h のヒドロゲル殺菌できるようにします。 0.5% 重量/体積 sulfosuccinimidyl 6-(4 ‘-アジドフェニル-2’-nitrophenylamino) ヘキサン酸の混合物を準備 (スルホ-SANPAH、材料の表を参照してください) 1 %dmso と 50 mM HEPES pH = 7.5。 この溶液 200 μ L をゲルの上面に追加します。UV を公開、高速動作 (302 nm) それらをアクティブにする 10 分間。 2 回を 1 mL 50 mM HEPES pH のヒドロゲルを洗う = 7.5。繰り返し任意の余分な架橋剤を確実に必要な場合は削除されます。 タンパク質-0.25 mg/mL ラット 200 μ L をゲルのコート尾コラーゲン私 (材料の表を参照) で 50 mM HEPES の。上、室温で一晩コラーゲン溶液とゲルを孵化させなさい。注: 脱水/蒸発を防ぐためには、二次封じ込めでウェルのプレートを配置し、格納容器の内部の周囲の水に浸したティッシュをクリーニング研究室を追加します。 40 X 目的と落射蛍光または共焦点の顕微鏡を使用して、ゲルの厚さを測定します。(ガラス面は) 下の z 位置を配置することによってそうとトップ (蛍光ビーズの強度が最大) ハイドロゲルの平面。その後、高さ z の位置を減算します。注意: 使用して逆落射蛍光顕微鏡と 40 × 対物開口数 0.65 と、ゲルの厚さを測定します。原子間力顕微鏡による測定 (AFM) は、(図 2参照) ヒドロゲルの正確な剛性を確認するこの時点で実行できます。 利息、ゲルの細胞を播種する前に、ゲル上のメディアの 1 つの mL を追加し、平衡を確保するため 1 時間に 30 分の 37 ° C でそれらを孵化させなさい。注: 我々 はどこモデル宿主細胞 (HMEC-1) (詳細については手順 2.1を参照) で培養したメディアであるため MCDB 131 一杯になったメディアを追加しました。 図 2: PA ハイドロゲル剛性とビーズの分布の AFM 測定。A. データ PA の期待のヤング率 (剛性の測定) を表示は、ハイドロゲル、アクリルアミドの量を考えると bis アクリルアミド使用する原子間力顕微鏡によるヤング率 (N = 5-6)。水平バーは、平均値を表しています。ゲルがので非常に柔らかく、AFM の先端に付着、0.6 kPa ヒドロゲルの剛性を測定できなかった。B. これは合流する HMEC 1 セルの位相画像とソフト 3 kPa PA ハイドロゲルの最優位の表面に埋め込まれたビーズの対応するイメージ。HMEC 1 は、ウェルあたり 4 x 10 の5セルの濃度で 24 h の播種。C.図 2Bとして、硬い 70 kPa PA ハイドロゲルに存在する細胞のため、この画像は同じ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 2. 人間の微小血管内皮細胞培養およびゲル上シード HMEC 1 を文化 (人間、微小血管内皮) MCDB 131 細胞 10% 牛胎児血清、表皮の成長因子の 10 ng/mL、ヒドロコルチゾン、1 μ g/mL と L-グルタミン (を参照してください材料表の 2 mM を添加した MCDB 131 メディアを含むメディアがフル). 分割 1:6 の合流の文化ごとに 3-4 日と 40 の通路まで細胞を維持します。 1 日、実験の前に、0.25% トリプシン/EDTA で文化血管から細胞をデタッチします。最初のセルとその培養器 1 を洗う x 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 5-10 分の 37 ° C でフラスコをインキュベート 0.25% トリプシン/EDTA (100 mm ディッシュや 75 cm フラスコ、60 mm ディッシュやフラスコ 25 cm あたり 1 mL につき 2 mL) の適切な量を追加基板から細胞の剥離をできるようにします。 MCDB 131 フル メディア、細胞の塊を破るし、円錐形遠心管にソリューションを配置に優しくピペットの適切なボリュームを追加してトリプシンを中和します。 優しくセル均等に分散して、ソリューションの 20 μ L を取るように細胞のソリューションを旋回し、非常に優しくガラス検定の coverslip の下に 2 つの部屋を記入します。 ペレット 500 x g で 10 分間遠心分離を使用して円錐形遠心管に含まれるセルのソリューションを。 10 分待機期間中に診断を使用してセルをカウントします。顕微鏡を使用して 10 × 対物と検定のグリッド行に焦点を当てる、1 mm × 1 mm 平方に 1 つのセルの数をカウントする手集計カウンターを使用します。 別 1 mm × 1 mm の正方形に、検定を移動、そこのセルをカウント、さらに 2 回この手順を繰り返します。4 つの測定値の平均を計算し、掛ける 10 の平均4。最終的な値は、実行可能なセル/mL 遠心分離されて、細胞の懸濁液の数です。 細胞ペレットは中断されないことを確保しながら円錐形遠心分離機管から液体を削除します。4 x 105セル/mL の濃度で MCDB 131 フル メディアで細胞を再懸濁します。 まず、ゲルを培養メディアを削除して各ゲルの細胞懸濁液の 1 mL を追加して、懸濁液、ゲル上の細胞を播きます。 3.菌、リステリア菌と人間の血管内皮細胞の感染症 事前準備注: は、次の解決策を事前に準備します。 クロラムフェニ コール、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン株式 ストレプトマイシン硫酸塩 0.5 g を計量し、10 mL の超純水水に完全に溶解ストレプトマイシンの 50 mg/mL の原液を準備します。 クロラムフェニ コールの 75 mg を計量し、100% エタノール 10 mL に完全に溶解クロラムフェニ コールの 7.5 mg/mL の原液を準備します。 硫酸ゲンタマイシンの 0.2 グラムの重量を量る 10 mL の超純水水に完全に溶解ことにより、ゲンタマイシンの 20 mg/mL の原液を準備します。 すべて原液 0.2 μ m のシリンジ フィルターをフィルター滅菌し、長期使用 (1-2 ヶ月) のための-20 ° C で保存します。 脳心注入 (BHI) メディアと寒天プレート 2 つの 1 L フラスコを検索し、各フラスコ内電磁攪拌棒を追加します。 BHI メディア BHI 粉末 37 g 1 つのフラスコで、純水 1 l. ミックス ソリューション粉末を溶解するまで電磁攪拌プレートにフラスコを置くことによって積極的に追加します。 BHI 寒天 37 g BHI パウダーとグラニュー寒天 15 g を追加 (材料の表を参照してください) 第 2 フラスコ内で粉体を溶解するまで電磁攪拌プレートにフラスコを置くことによって純水 1 l. ミックスまでのソリューションを積極的に追加し、。 余りに堅く、フラスコの蓋をネジとオートクレーブを設定またはオートクレーブの仕様によると、液体を用いたソリューション。 オートクレーブからソリューションを削除し、55 ° C に BHI 寒天ソリューション クールダウン1 L フラスコで BHI メディアが滅菌保持されている場合ために使用することができます 1 ヶ月まで。 BHI 寒天培地プレートに細菌を準備するには、に応じて、BHI 寒天培地 (によって成長する細菌の緊張) を含むフラスコにまず抗生物質を追加します。急速混合できるように電磁攪拌板にフラスコを簡潔に入れます。注: ここで使用される抗生物質 Lm 供に特有ですが、BHI 寒天で、必要に応じて抗生物質を使用できます。10403S Lm 系統、ストレプトマイシンに対する耐性があるために、濃度 200 μ G/ml と 7.5 μ g/mL の濃度にクロラムフェニ コールにストレプトマイシンをしました。これらの系統がされている共役、クロラムフェニ コールのアセチルトランスフェラーゼ開いたリーディング ・ フレーム、それゆえを含むプラスミドとクロラムフェニ コールへの抵抗。 注ぎ混合物 10 cm ポリスチレン細菌培養皿 (プレートごと約 20 mL)。気泡を取り除くために、プレートの上面を簡潔に炎します。クール プレートは室温で一晩します。 次の日、乾燥プレートをシールし、4 ° C で保存 菌、リステリア菌と人間の血管内皮細胞の感染 感染前に、3 日間 Lm うち連勝は 7.5 μ g/mL クロラムフェニ コール、ストレプトマイシンの 200 μ G/ml が含まれる場合、適切な BHI 寒天培地プレート上に (-80 ° C で保存) グリセロール ストックから使用するひずみ。注: を縞にするのにひずみは野生型や変異、恒常発現 (JAT1045 を用いて染色) 用蛍光または ActA プロモーター (流れの cytometry または牽引力の顕微鏡の JAT983 または JAT985 の下で蛍光を表現をすることができます。使用された)22。 (1-2 日) の植民地離散までは、37 ° C でプレートを孵化させなさい。 感染、前日は成長目的のひずみ、一晩 30 ° c (該当する場合) はクロラムフェニ コールの 7.5 μ g/mL と BHI メディアで 150 rpm で揺れているようです。 場所 5 mL の遠心分離機 15 mL コニカル チューブに BHI 培クロラムフェニ コール (該当する場合)、7.5 μ g/mL を加えるし、寒天培地滅菌 10 μ L チップを使用してから単一コロニーを接種します。 感染の直前に、次の日 600 でバクテリア溶液の光学密度を測定サンプル 1:5; を希釈して nm (OD600)空白として使用するだけで BHI を含むキュベットを使用します。 0.1 の OD600 に一晩かけて培養を希釈し、7.5 μ g/ml のクロラムフェニ コール (該当する場合) の BHI メディアでの 30 ° C で 2 時間ログ相成長に到達する細菌を許可するように揺れ、それを孵化させなさい。 測定 0.2 – 周りに予想される細菌のソリューションの OD600 0.3。0.2 – でそれを希釈、OD600 が高い場合、BHI だけで 0.3。 微量遠心チューブに細菌溶液 1 mL を入れます。室温で遠心分離を使用して 2,000 x g で 4 分の間それを回しなさい。上澄みを除去し、組織培養グレード PBS、ティッシュ文化フードの 1 mL の細菌のペレットを再懸濁します。室温で 2,000 x g で 4 分のそれらを回すことによって倍の細菌を洗浄します。上澄みを除去し、1 mL の PBS の細菌を再懸濁します。 MCDB 131 フル メディア (MOI; 感染症の多様性のための 1 mL の PBS で再停止される細菌の 10 または 50 μ L を混合することによって感染のミックスを準備します。すなわち、宿主細胞あたりの菌数) 約 50 細菌宿主細胞や宿主細胞あたり 10 細菌の。 ゲルまたはセルを妨害しないように注意してください 24 ウェル プレートの井戸からメディアを削除します。洗浄セル 1 MCDB 131 の 1 ml x メディアがフルし、各ウェルに細菌の 1 つの mL を追加。 MOI の決定のためのいくつかの感染症ミックス (少なくとも 100 μ L) を維持 (ステップ 3.3を参照)。 カバーの蓋付きプレートと漏れを避けるために食品ラップをポリエチレンでプレートをラップします。遠心分離機でプレートを配置し、侵攻を同期する 200 x g で 10 分間のサンプルをスピンします。組織培養の定温器にプレートを移動し、37 ° C で 30 分間インキュベートそれら サンプル 4 を洗う MCDB 131 x メディアがフルし、組織文化のインキュベーターにそれらを移動します。さらに 30 分後に、ゲンタマイシンの 20 μ G/ml を添加したメディアでメディアを置き換えます。 感染症 (MOI) の多様性の定量 細菌と宿主細胞の最初の 30 分孵化中に、MOI を決定する感染ミックスの 10 倍のシリアル希薄を準備します。1 × PBS (10-1希釈) の 900 μ L で感染ミックスの 100 μ L を混合することによって 10 倍希釈液を作る。900 μ L の PBS (10-2希釈) 10-1希釈の 100 μ L を混ぜます。 10-5希釈が得られるまで続けます。注: すべてのソリューションは、よくそれらを希釈する前に混合する必要があります、新鮮なきれいなピペット チップは各ステップで使用する必要があります。 希釈を加えた後、10-2 – (該当する場合)、BHI、寒天、クロラムフェニ コール、ストレプトマイシン プレートの中心に 10-5希釈液 100 μ L を配置します。 フックを作成するピペットを曲げないように火を使用してガラス ピペットから散布を行います。殺菌のため 100% エタノールでピペットを浸し、その後、炎を上げてエタノールを燃焼します。 拡散機を冷却して、一度 10-5希釈から始まってより集中しているミックスに移動板に均一細菌希釈を広めます。2 日間の 37 ° C で逆さま版を孵化させなさい。 コロニーの密度に応じていずれか 10-3 10-4または 10-4と 10-5希釈プレートのコロニーの数を決定します。慣性モーメントを次のように計算します。植民地 × 希釈係数 ÷ ボリュームの初期追加数 μ L あたり CFU の数 =μ L/ウェル菌ミックス × 量あたり CFU の数 = 井戸あたり CFU の数井戸ごとのセル × ボリュームも CFU の数 = セルあたりの細菌数注意: CFU 意味コロニー形成単位。 最終的なモアを取得する 2 つのプレートからモアを平均します。 4. 感染宿主細胞の細胞外マトリックス剛性依存感受性を定量化するためのフローサイトメトリー コラゲナーゼの 5 mg の重量を量る、15 mL の円錐形遠心管中に置きます。0.25% トリプシン-EDTA の 10 mL を追加し、よく混ぜます。 8 h 感染後、24 ウェル プレートの井戸からメディアを取り出し、洗浄 1 培養 PBS で x。井戸から PBS を削除し、各ウェルにトリプシン-EDTA/コラゲナーゼ ミックス 200 μ L を追加します。セルの完全離脱を許可する 10 分間培養孵卵器でこれを置きます。 井戸およびピペット 8 x 上下ミックスごとに新鮮なピペットを使用します。細胞を損傷しないように優しくすること。トリプシンを中和するために各ウェルに一杯になったメディアの 200 μ L を追加します。 35 μ m セル ストレーナー キャップ付き 5 mL ポリスチレン管各ウェルの 400 μ L 携帯ソリューションに転送 (材料の表を参照してください)。 フローサイトメトリーによるサンプルごとの 10,000-20,000 の細胞を分析します。フローサイトメトリーによるデータ取得を実行し、/ウェル関連の市販ソフトウェアを使用して感染した細胞の割合を決定します。細胞数の分布の大部分をゲート側散布と前方散乱を使用します。注: これは単一細胞を分析を確保し、残骸または細胞ダブレットまたは三つ子を排除します。 制御感染細胞からの蛍光信号を測定し、蛍光を除く感染細胞の人口のゲートします。 5. 細胞細菌顕微鏡画像処理の免疫染色 注: このアプローチは ECM 剛性依存細菌付着細菌の内面 (侵略)、ホスト内で対ホスト細胞表面上に区別するためにされます。 図 4: Lm 感染 HMEC 1 の免疫染色は細胞侵入対細菌の付着を区別するためにさまざまな剛性のヒドロゲル上します。これらの画像は、 Aを示す差分免疫染色の代表的な例を示します。細胞核 (DAPI) B。すべての細菌 (GFP) とC。外の細菌 (Alexa-546)。HMEC 1 セルがソフト 3 kPa ハイドロゲルに寝泊まりしていた。矢印は、緑のチャネルのみに表示されるように内在している細菌をポイントします。Dデータ N を参照してF = 感染 HMEC 1 セル ソフト 3 kPa と硬い 70 kPa ゲルおよびDを表示の上の 20 の画像。核; あたり合計細菌E. 核; あたり内面化された細菌とF. 侵入効率 (全細菌に内面化された細菌の比率)。水平のバーは、データの意味を表しています。P-値を求めた非パラメトリック Wilcoxon ランク合計テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 感染後 30 分、洗浄 HMEC 1 細胞感染 JAT1045 (恒常緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表現する Lm) 4 x メディアを。 第 4 回洗浄後 MCDB 131 一杯になったメディアの 1 mL と 1 mg/mL の 1 μ L ヘキスト染料を混ぜるし、細胞の核を染色する各ウェルに追加。10 分間培養孵卵器にセルを配置します。 1 セルを洗浄して PBS の x。部屋温度28で 20 分の差分免疫染色の構造の非固定液で固定します。注: 固定液には、0.32 M ショ糖、10 mM MES pH 6.1 138 mM KCl、MgCl2、3 mM 2 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、および 4% のホルムアルデヒド (電子顕微鏡グレード) が含まれています。 1 セルを洗浄して PBS の x。5% ウシ血清アルブミンとの 30 分のためのサンプルのブロック (表の材料を参照) PBS で。 アンチ Lm で 1 h のサンプルをインキュベート一次抗体 (を参照してください材料表) 2 %bsa を含む PBS で 1: 100 希釈します。 PBS 3 でサンプルを洗う x し、それらをインキュベートして 1 h AlexaFluor 546 ヤギ抗うさぎ抗体は 2 %bsa を含む PBS で 1: 250 を希釈 (材料の表を参照してください)。サンプル 3 を洗って PBS で x。イメージングのための 1 mL の PBS のサンプルを格納します。 イメージし、条件ごとの以上 1,000 セルを分析します。 CCD カメラを使用して逆落射蛍光顕微鏡、イメージングのため (材料の表を参照してください)、0.6 開口数 (NA) と空気計画蛍石空気目的 X 40。注: 力は 25% に設定され、100 さんに露出時間 mCherry 用顕微鏡フィルターが 470/525 nm、GFP 530/645 nm の励起と放射のための DAPI 395/460 nm のそれぞれ。我々 が使用される顕微鏡は、オープン ソース顕微鏡ソフトウェア パッケージ29によって制御されました。 差分免疫染色の付着として個々 のセルに関連付けられたすべての ‘緑’ 細菌を数えます。’緑’ と ‘赤’ (のために抗体の結合) として内在化している非細菌を数えます。注: カスタム スクリプトと CellC ソフトウェアを実行することによって核数がわかりました (材料の表を参照してください) 細菌30の列挙。 6 ウェル牽引力顕微鏡および単分子膜応力顕微鏡 図 5:感染時の ECM に出す牽引力のマグニチュードを減少させる Lm 感染 HMEC 1 セル.パネルAは位相画像Bは変形場を示して、 Cが牽引応力場やDショー、20 kPa ハイドロゲル上感染 HMEC 1 細胞の細胞内張力場を示しています。変形のカラーバー マップ (μ m)、牽引力のストレス マップ (Pa)、細胞内張力のマップ (nNµm-1) は、ヒート マップの上部に表示されます。列に 3 つの代表的な時間ポイントが表示: 3, 8, 18 h の感染後。E H。パネルA~D 300 の MOI で Lm 感染細胞と同じです。細菌 (赤のチャネル) の画像をセルの位相画像に重ね合わせます。TFM の録音は、同時に複数の井戸をイメージングによって実施されました。PIV のウィンドウ サイズは、16 の重なる部分が 32 ピクセルをだった。スケール バーは、32 μ m です。この図は、Bastounis と・ テリオ59から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 24 ウェル プレートに PA ヒドロゲルを準備 (手順 1を参照)。Seed HMEC 1 (手順 2を参照) を細胞し、それらを感染と前述の JAT983 上記 (手順 3を参照)。 10% 牛胎児血清、表皮の成長因子の 10 ng/mL、1 μ g/mL ヒドロコルチゾン リーボビッツの L-15 を継ぎ足すことによって住んでいる顕微鏡媒体を準備します。注: L-15 は、MCDB 131 メディアの場合と同様に余分なを追加する必要はありませんので、2 mM L-グルタミンを既に存在します。 4 h の後感染 (起動時内面 JAT983 蛍光を発する) L-15 一杯になったメディアの 1 mL と 1 mg/mL の 1 μ L ヘキスト染料を混ぜるし、細胞の核を染色する各ウェルに追加。10 分間培養孵卵器にセルを配置し、各ウェルの L-15 フル メディアに置き換えます L-15 ゲンタマイシンの 20 μ G/ml を添加した完全なメディアの 1 mL。 カバー プレート蓋と場所を顕微鏡の試料室には 37 ° C に平衡 (材料の表を参照してください)。注: 画像を CCD カメラ逆落射蛍光顕微鏡を使用 (材料の表を参照してください)、0.6 と空気計画蛍石空気目的 X 40 na という 蛍光ビーズや蛍光菌のコマ撮り画像をマルチ チャンネルと宿主細胞、4 に 12 時間 10 分毎の位相コントラストの画像を取得します。注: イメージングのための力は 25% に設定された、100 さんに露出時間 mCherry と GFP 用顕微鏡フィルター (励起/蛍光) 470/525 nm と 530/645 nm それぞれ。 録音の最後に、各井戸の水で 10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 500 μ L を追加します。注: セルは、ハイドロゲルからデタッチされ、ヒドロゲルは弾性があるので、初期の変形前の状態に戻ります。 ヒドロゲルのイメージを取るし、参照変形していないイメージとしてそれを使用します。 粒子画像流速測定法 (PIV)31、変形前のハイドロゲルの参照画像をコマ撮りシリーズの各画像を比較を使用して時間の各瞬間、ハイドロゲルの二次元変形を決定します。適切なウィンドウ サイズを使用し、実験によって重複。注意: 16 ピクセルの重なる部分が 32 ピクセルのウィンドウを使用しています。 細胞に与えるハイドロゲルも32,332D 牽引応力を計算します。 牽引ストレスから単分子膜張力前述の単分子膜に PA ハイドロゲルによって作成された反力を受ける弾性平板の力学的平衡の方程式を解くことによって34の方法を計算します。測定の牽引ストレス サインの反対。注: は、補足資料 1を参照してください。 7 査定細胞外マトリックス剛性依存菌、リステリア菌の普及を通じて内皮細胞と微速度顕微鏡観察定量 図 6: HMEC 1 分子を介して Lm 普及のタイムラプス定量顕微鏡データは 3 kPa および 70 kPa 剛性を有する基板上にシードします。A.このパネルはまだ 0、200、400、600 分、2 つの代表的な感染巣からのイメージを示しています。相チャネルを示し HMEC 1 細胞膜、赤のチャネルは、細胞内の Lm を示しています (プロトコルの手順 7を参照)。B。 このパネルは、時間の関数としてプロット感染症フォーカスを包含凸包の領域を示しています。3 kPa 状態 (赤) のフォーカス エリアは (緑) では 70 kPa のより速く育ちます。C.このパネルは、感染病巣 (赤) 3 kpa PA 基板上にシード HMEC 1 単分子膜の成長と 70 kPa (グリーン) 剛性感染症フォーカスの端に中心からの放射状の距離が担当者の時間の関数としてプロットを示しています。放射状の速度 (dr/dt) は、70 kPa 条件の相性、3 kPa 条件一定です。D. これらのデータが 10 の独立した感染巣の最初の 200 分の放射状の速度を示します。赤 (3 kPa) と緑 (70 kPa) のデータ ポイントを描く前のパネルで説明している 2 つの巣の斜面。水平のバーは、データの意味を表しています。P-値を求めた非パラメトリック Wilcoxon ランク合計テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 24 ウェル プレートに PA ヒドロゲルを準備 (手順 1を参照)、シード HMEC 1 セル (手順 2を参照)、および (を参照してくださいステップ 3) 上記のように一晩 JAT983 文化を育てます。 感染症の日 MCDB 131 一杯になったメディアの mL あたり細菌ペレットの 10 μ L を混合することによって感染のミックスを準備します。慎重に 24 ウェルの井戸からメディアを削除し、各ウェルに 1.9 mL MCDB 131 フル メディア、細菌のミックスの 0.1 mL を追加します。注: この試金で使用される低い慣性モーメントから単一の細菌が宿主細胞に侵入を開始する普及イベントを分析する必要は。 その蓋付きプレートをカバーし、漏れを避けるためにプラスチック製のラップでそれを封印します。遠心分離機でプレートを配置し、侵攻を同期する 200 x g で 10 分間のサンプルをスピンします。 組織培養の定温器にプレートを移動し、5 分間インキュベートします。 洗浄サンプル 4 x メディアをし培養孵卵器に移動します。追加の 5-7 分後に、ゲンタマイシンの 20 μ G/ml を添加したメディアでメディアを交換します。 ActA プロモーターをオンにし、mTagRFP の発現を開いたリーディング ・ フレーム35にドライブできるように余分な 5 時間のためのインキュベーターでプレートを孵化させなさい。 10% 牛胎児血清、表皮の成長因子の 10 ng/mL、1 μ g/mL ヒドロコルチゾン リーボビッツの L-15 を継ぎ足すことによって住んでいる顕微鏡媒体を準備します。注: L-15 は、MCDB 131 メディアの場合と同様に余分なを追加する必要はありませんので、2 mM L-グルタミンを既に存在します。 1 mg/mL ヘキストのミックス 1 μ L 1 ml L-15 一杯になったメディアの色素し、細胞の核を染色する各ウェルに追加。10 分間培養孵卵器にセルを配置し、各ウェルの L-15 フル メディアに置き換えます L-15 ゲンタマイシンの 20 μ G/ml を添加した完全なメディアの 1 mL。カバー プレート蓋と場所を顕微鏡の試料室には 37 ° C に平衡 (材料の表を参照してください)。注: イメージング、逆落射蛍光顕微鏡を用いて CCD カメラで (材料の表を参照してください)、0.75 と空気計画蛍石空気目的 X 20 na という力が 50% に設定され、50 ms までの露光時間 mCherry 用顕微鏡フィルターが 470/525 nm 励起と放射のそれぞれ。 Lm がどのように HMEC 1 分子を介して拡散を監視するオート フォーカス機能を使用して 5 分ごとに複数の位置が可変剛性ヒドロゲルにシードのイメージ。注: L-15 がバッファーされ HEPES、イメージング中に CO2を使用する必要はありませんので。