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Immunology and Infection

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Published: July 05, 2018
doi:
10.3791/57361
, , ,
1Department of Biochemistry,Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering,University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute,Stanford University School of Medicine

Summary

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l’effetto di rigidità di matrice extracellulare sull’infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Abstract

Rigidità di matrice extracellulare comprende uno degli stimoli meccanici ambientali multipli che sono ben noti per influenzare il comportamento cellulare, funzione e destino in generale. Anche se le risposte dei sempre più più tipi di cellule aderenti alla rigidità di matrice sono state caratterizzate, come aderente suscettibilità delle cellule all’infezione batterica dipende dalla rigidità della matrice è in gran parte sconosciuta, come è l’effetto dell’infezione batterica sul biomeccanica della cellula ospite. Supponiamo che la suscettibilità delle cellule endoteliali dell’ospite ad un’infezione batterica dipende dalla rigidità della matrice in cui queste cellule risiedono, e che l’infezione dell’ospite le cellule con i batteri cambierà loro biomeccanica. Per verificare queste due ipotesi, le cellule endoteliali sono state utilizzate come modello host e Listeria monocytogenes come agente patogeno di modello. Lo sviluppo di un’analisi del romanzo formato multi-pozzetto, indichiamo che l’effetto di rigidità di matrice sull’infezione di cellule endoteliali da L. monocytogenes può essere valutata quantitativamente mediante citometria a flusso e immunostaining seguita da microscopia. Inoltre, utilizzando la microscopia a forza della trazione, l’effetto dell’infezione di L. monocytogenes biomeccanica delle cellule endoteliali host possa essere studiato. Il metodo proposto permette l’analisi dell’effetto della meccanica del tessuto-rilevanti sull’infezione batterica delle cellule aderenti, che è un passo fondamentale verso la comprensione delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare, e batteri patogeni. Questo metodo è anche applicabile a una vasta gamma di altri tipi di studi sulla biomeccanica di cella e la risposta alla rigidità del substrato dove è importante essere in grado di eseguire molte repliche in parallelo in ogni esperimento.

Introduction

Cellule in tessuti più animali sono in genere aderente, allegare sia di cellule vicine e alla loro matrice extracellulare (ECM). L’ancoraggio delle cellule alla loro ECM è fondamentale per molti processi cellulari che vanno da motilità cellulare a cellule di proliferazione e sopravvivenza1,2. Cellulare ancoraggio alla ECM dipende la composizione di ECM e la rigidità. Le cellule rispondono ai cambiamenti in quest’ultimo di riorganizzare in modo dinamico la loro citoscheletro, adesioni cellula-ECM e cellula-cellula, che a sua volta criticamente alterano cella biomeccanica e funzioni3,4,5,6 . Rigidità di ECM può variare nello spazio (cioè, posizione anatomica), nel tempo (cioè, invecchiamento) e in processi patofisiologici (ad es., arteriosclerosi, cancro, infezioni, ecc.). Per esempio, è ampiamente accettato che endoteliali cellule che risiedono su più rigido-rispetto al più morbido-matrici esercitano forze aumentate a loro ECM e a vicenda ed esibiscono aumentata motilità e proliferazione di7,8. Allo stesso modo, fibroblasti che risiedono su matrici più rigidi conferiscono elevata forza contrattile per loro ECM e visualizza aumentata proliferazione, motilità ed ECM produzione9,10,11. Anche se cella meccanica e risposta alla rigidità di ECM sono stati studiati estesamente per vari tipi di cellule, il rapporto tra cellule aderenti, la rigidità delle loro ECM e infezioni batteriche è ancora in gran parte sconosciuta.

Per studiare il ruolo della rigidità di ECM in interazioni delle cellule batteri-ospite, L. monocytogenes (Lm) è stato scelto come l’agente patogeno del modello. LM è un batterio ubiquista di tossinfezione alimentare che possa causare infezioni sistemiche in un’ampia varietà di mammiferi padroni di casa. Questo agente patogeno intracellulare facoltativo può spostare dall’epitelio intestinale in organi distanti passando attraverso diversi tipi di endotelio vascolare. Se si apre un varco la barriera emato – encefalica, Lm può causare la meningite, e quando attraversa la placenta, può causare aborto spontaneo12,13. LM può infettare tipi cellulari diversi host e può farlo utilizzando strategie patogene distinte. Infezione di LM è stato studiato principalmente nel contesto delle cellule epiteliali, mentre molto meno è conosciuto circa come Lm può infettare e bypass cellule endoteliali che allineano il lume dei vasi sanguigni14,15,16. Inoltre, è ancora in gran parte sconosciute come la rigidità del ECM dove risiedono le cellule endoteliali modula capacità di Lm di invadere queste cellule dell’ospite e per poi diffondersi. LM e diverse altre specie batteriche (cioè, Rickettsia parkeri) approfitta del citoscheletro dell’host cellule che infettano a entrambi invadono nel loro citoplasma e facilitano la diffusione della cellula–cellula17 , 18 , 19. che raggiungono attraverso l’espressione di proteine che permettono loro di interferire con le vie di polimerizzazione dell’actina host e di produrre code di cometa di actina che facilitano la loro propulsione16,20. Come conseguenza dell’infezione, il citoscheletro della cellula ospite ha bisogno di riorganizzare in modo dinamico in un modo che è ancora non completamente caratterizzato, potenzialmente influenzare la biomeccanica delle cellule dell’ospite, tra cui le forze fisiche che esercitano sul loro ECM e su ciascuna altri. Per esaminare questi processi, cellule endoteliali microvascolari umane (HMEC-1) sono stati scelti come cellule dell’ospite modello per tre motivi: 1. le cellule endoteliali sono noti per essere altamente mechanosensitive poiché sono sempre esposte a vari spunti fisici21; 2. le strategie che LM impiega per infettare le cellule endoteliali sono ancora in gran parte sconosciuto22; e 3. HMEC-1 sono una linea di cellule immortalizzate e possono, pertanto, essere facilmente coltivate e sottoposti a manipolazione genetica.

Infezione batterica delle cellule dell’ospite è stato studiato in vitro seminando cellule su vetro o polistirolo substrati che sono significativamente più rigidi di ECM fisiologico della maggior parte delle cellule12,14,23. Per esaminare l’infezione delle cellule seminate su una matrice la cui rigidità è fisiologicamente rilevanti e per delucidare il ruolo di rigidezza di ECM sull’infezione delle cellule di batteri patogeni, abbiamo seguito un approccio innovativo basato sulla fabbricazione di sottile poliacrilammide incorporato della microperla idrogeli di rigidezza sintonizzabile su piastre multi-pozzetto. La novità dell’approccio proposto risiede in quanto esso consente il monitoraggio più condizioni contemporaneamente grazie al suo formato multi-pozzetto e in quanto è compatibile con le tecniche multiple a causa di quella particolare che i substrati sono costruiti. Cellule HMEC-1 sono state seminate su questi idrogeli rivestite con proteine e poi infettate da diversi ceppi di Lm che diventano fluorescenti all’interiorizzazione o sono costitutivamente fluorescenti. Il ruolo della rigidità di ECM sulla suscettibilità di infezione delle cellule HMEC-1 ospite è stato valutato da citometria a flusso. Inoltre, microscopia di fluorescenza e di immunostaining sono stati utilizzati per distinguere tra batteri aderenti e interiorizzati. Infine, microscopia di forza di trazione (TFM) è stato effettuato con successo per caratterizzare l’effetto dell’infezione di Lm sulle sollecitazioni di trazione che cellule endoteliali dell’ospite esercitano il loro matrici durante l’infezione. Il saggio presentato può essere facilmente modificato per abilitare ulteriori studi sull’effetto di rigidità ECM sulla suscettibilità di infezione delle cellule aderenti utilizzando linee cellulari differenti o agenti patogeni.

Protocol

1. produzione di idrogel di poliacrilamide due strati sottili (PA) su piastre multi-pozzetto Sciogliere ammonio persolfato (APS) in acqua distillata ultrapura per ottenere una concentrazione finale di 10 g/mL. Aliquotare e conservare la soluzione a 4 ° C per uso a breve termine (3 settimane).Nota: La soluzione di cui sopra possa essere preparata in anticipo di fabbricazione di idrogel. Attivazione di vetro di 24 pozzetti piatti Incubare 24 pozzetti vetro piastre inferiori con 13 pozzi di diametro mm (Vedi Tabella materiali) per 1 h con 500 µ l di NaOH M 2 per pozzetto a temperatura ambiente. Lavare i pozzetti 1 x con acqua ultrapura e quindi aggiungere 500 µ l di 2% (3-amminopropil) trietossisilano (Vedi Tabella materiali) in etanolo al 95% a ogni bene per 5 min. Lavare i pozzetti 1 x nuovamente con acqua e aggiungere 500 µ l di 0,5% glutaraldeide in ciascun pozzetto per 30 min. lavare i pozzetti 1 x con acqua ed asciugate a 60 ˚ c con il coperchio. Figura 1 : Analisi di infezione batterica delle cellule ospiti che risiedono su idrogel sottile a doppio strato fluorescente incorporato perlina poliacrilammide (PA) di rigidità variabile. R. lamelle di vetro sono chimicamente modificate per consentire l’attaccamento di idrogel. B. 3,6 µ l delle miscele di PA sono depositati sul fondo di vetro. C. la miscela è coperto con un vetrino coprioggetto circolare in vetro 12 mm per consentire di polimerizzazione. D. il coprioggetto viene rimosso con un ago di siringa. E. 2.4 µ l di una soluzione di PA con microsfere è aggiunto sopra lo strato di fondo e tappate con un coprioggetto in vetro circolare. F. un buffer viene aggiunto nel pozzo e viene rimosso il vetrino coprioggetti. G. irradiazione UV per 1 h garantisce la sterilizzazione. H. viene aggiunta una soluzione contenente Sulfo-SANPAH sui gel, che vengono poi poste sotto UV per 10 min ho. Nel caso degli idrogeli è lavate con un buffer e quindi incubate durante la notte con collagene I. J. L’idrogel è equilibrata con media delle cellule. K. cellule dell’ospite sono seminate. L. Batteri di LM vengono aggiunti alla soluzione e l’infezione è sincronizzato tramite centrifugazione. M. 1h post-infezione batteri nella soluzione vengono lavati via e supporti completati con un antibiotico sono aggiunto. N. A post-infezione 4h, Lm (JAT985) inizia con la dicitura. O. cellule HMEC-1 sono staccate dalla loro matrice e le soluzioni vengono trasferite ai tubi per eseguire misure di citometria a flusso. Si noti che sono inoltre indicate giorni e orari approssimativi per ogni passo del test. Questa figura è stata modificata da Bastounis e Theriot59. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Fabbricazione di idrogel di poliacrilamideNota: Vedere nella figura 1. Preparare soluzioni acquose contenenti 3-10% di soluzione di acrilammide stock di 40% (Vedi Tabella materiali) e 0,06 – bis-acrilammide soluzione di riserva di 0,6% del 2% (Vedi Tabella materiali) per la fabbricazione di idrogeli di rigidezza sintonizzabile che vanno da 0,6 kPa a 70 kPa. Vedere tabella 1. Per 0,6 kPa idrogeli, mescolare 3% di acrilammide con 0,045% bis-acrilammide. Per 3 kPa idrogeli, mescolare 5% di acrilammide con 0,074% bis-acrilammide. Per 10 kPa idrogeli, mescolare 10% di acrilammide con 0,075% bis-acrilammide. Per 20 kPa idrogeli, mescolano 0,195% bis-acrilammide 8% di acrilammide. Per 70 kPa idrogeli, mescolare 10% di acrilammide con 0,45% bis-acrilammide.Nota: Maggiori dettagli sul raggiungimento la rigidità di idrogel PA desiderabile possono essere trovati altrove24,25,26,27. Preparare due soluzioni acquose per ogni rigidità di idrogel desiderabile. Preparare soluzione 1 per essere privo di tallone e soluzione 2 per contenere 0,03% 0,1 µm diametro fluorescenti micro-perline (Vedi Tabella materiali). Degas soluzioni 1 e 2 dal vuoto per 15 min per eliminare ossigeno che è noto per inibire la polimerizzazione delle soluzioni. Aggiungere 0,6% dei 10 g/mL di brodo di soluzione APS e 0,43% tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione 1 per abilitare un’iniziazione di polimerizzazione. Agire in fretta. Aggiungere al centro di ciascun pozzetto del piatto 24 pozzetti 3,6 µ l di soluzione 1 (Vedi punto 1.2 per la sua preparazione). Immediatamente coprire i pozzetti con 12mm coprioggetti circolari non trattati e lasciate soluzione 1 riposare per 20 min in modo che esso si polimerizza completamente. Picchiettare delicatamente un ago di siringa ad una superficie per creare un piccolo gancio in punta per facilitare la rimozione delle lamelle. Sollevare i coprioggetti utilizzando l’ago della siringa. Aggiungere lo 0,6% dei 10 g/mL di soluzione madre di APS e 0,43% TEMED alla soluzione 2. Cassetta di 2,4 µ l della miscela sopra il primo strato in ciascun pozzetto del piatto 24 pozzetti. Coprire la soluzione 2 con lamelle di vetro circolare 12mm, delicatamente premendo verso il basso con un paio di pinze per garantire lo spessore del secondo strato è minima. Lasciare che la soluzione 2 polimerizzare per 20 min. Aggiungere 500 µ l di pH di 50 mM HEPES 7.5 a ciascuno dei pozzi e quindi rimuovere le lamelle di vetro con la siringa ed il forcipe. Sterilizzazione, collagene-rivestimento e l’equilibratura di idrogel di poliacrilamide UV-esporre l’idrogel per 1 h alla cappa di coltura del tessuto per consentire la sterilizzazione. Preparare una miscela di 0,5% peso/volume Sulfosuccinimidil 6-(4 ‘-azido-2 ′-nitrophenylamino) esanoato (Sulfo-SANPAH, Vedi Tabella materiali) pH di 1% DMSO e 50 mM HEPES = 7.5. Aggiungere 200 µ l di questa soluzione sulla superficie superiore nel caso degli idrogeli. Agisce velocemente, esporli ai raggi UV (302 nm) per 10 min per attivarli. Lavare l’idrogel due volte con 1 mL di pH HEPES 50 mM = 7.5. Ripetere se necessario per garantire che qualsiasi reticolante in eccesso viene rimosso. Nel caso degli idrogeli con 200 µ l di ratto di 0,25 mg/mL-cappotto della proteina collagene di coda ho (Vedi Tabella materiali) in 50 mM HEPES. Incubare gli idrogeli, con la soluzione di collagene sulla parte superiore, una notte a temperatura ambiente.Nota: Per evitare disidratazione/evaporazione, posizionare le piastre multi-pozzetto in un contenimento secondario e aggiungere laboratorio pulizia tessuti impregnati in acqua nella periferia interna di contenimento. È possibile utilizzare un epifluorescenza o microscopio confocale con un obiettivo 40x per misurare lo spessore nel caso degli idrogeli. Farlo individuando le posizioni z della parte inferiore (dove si trova la superficie di vetro) e top piani di idrogel (dove è massima intensità le palline fluorescenti). Quindi sottrarre le posizioni di z per determinare l’altezza.Nota: Abbiamo usato un microscopio a epifluorescenza invertito e un obiettivo 40x con apertura numerica 0.65 per misurare lo spessore nel caso degli idrogeli. Misure di microscopia a forza atomiche (AFM) possono essere eseguite anche a questo punto per confermare la rigidezza esatta di idrogeli (Vedi Figura 2). Prima di seminare le celle di interesse nel caso degli idrogeli, aggiungere 1 mL di media nel caso degli idrogeli e li Incubare a 37 ° c per 30 min a 1 h per garantire equilibrazione.Nota: Abbiamo aggiunto MCDB-131 completo media perché è il supporto dove le cellule dell’ospite di modello (HMEC-1) sono state coltivate in (Vedi punto 2.1 per i dettagli). Figura 2: misure AFM di PA idrogel rigidità e distribuzione dei branelli. A. dati mostrano il previsto modulo di Young (misura della rigidità) della PA idrogeli, dati la quantità di acrilammide e bis-acrilammide utilizzato contro il modulo di Young misurato mediante AFM (N = 5-6). Le barre orizzontali rappresentano la media. La rigidità nel caso degli idrogeli kPa 0,6 non potrebbe essere misurata perché nel caso degli idrogeli era molto morbidi e aderito alla punta del AFM. B. si tratta di un’immagine di fase di cellule HMEC-1 confluenti e l’immagine corrispondente dei branelli incorporato sulla superficie superiore di un idrogel morbido 3 kPa-PA. Il HMEC-1 sono state seminate per 24 h a una concentrazione di 4 x 105 cellule per pozzetto. C. questa immagine è la stessa come Figura 2B , ma per le cellule che risiedono su un idrogel di PA rigido 70-kPa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 2. coltura delle cellule endoteliali microvascolari umana e il Seeding in idrogel Cultura HMEC-1 (umano, microvascolare endothelial) cellule MCDB-131 completo supporti contenenti MCDB-131 media completati con 10% siero bovino fetale, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 1 µ g/mL di idrocortisone e 2 mM di L-Glutammina (Vedi tabella materiali ). Dividere le culture confluenti 1:6 ogni 3-4 giorni e mantenere le cellule fino al passaggio 40. Un giorno prima dell’esperimento, staccare le cellule dal loro vascello di cultura con 0,25% tripsina/EDTA. In primo luogo lavare le cellule e la loro nave di cultura 1 x con fosfato sterile tampone salino (PBS) e quindi aggiungere la quantità appropriata di 0,25% tripsina/EDTA (2 mL / 100 mm piatto o boccetta di 75 cm, 1 mL / 60 mm piatto o pallone da 25 cm), incubare la beuta a 37 ° C per 5-10 min per consentire il distacco delle cellule dal loro substrato. Neutralizzare la tripsina aggiungendo il volume desiderato di MCDB-131 completo media, pipettare delicatamente per rompere i grumi di cellule e quindi inserire la soluzione in una provetta conica per centrifuga. Delicatamente la soluzione delle cellule per garantire che le cellule sono distribuite uniformemente e poi togliere 20 µ l della soluzione di turbinio e molto delicatamente, compilare le due camere sotto il vetrino coprioggetto di un emocitometro di vetro. A pellet giù la soluzione delle cellule contenute nella provetta conica per centrifuga mediante centrifugazione per 10 min a 500 x g. Durante il periodo di attesa di 10 min, contare le celle utilizzando un emocitometro. Utilizzare un microscopio, concentrarsi sulle linee della griglia dell’emocitometro con un obiettivo da 10x e quindi utilizzare un contatore tally mano per contare il numero di cellule in un 1 mm x 1 mm quadrati. Spostare l’emocitometro un altro quadrato di 1 x 1 mm, contare le celle c’e quindi ripetere la procedura due volte. Calcolare la media delle quattro misurazioni e quindi moltiplicare la media per 104. Il valore finale è il numero di cellule/mL praticabile in sospensione delle cellule che è essere centrifugata. Rimuovere il liquido fuori la provetta conica per centrifuga, garantendo nel contempo che il pellet cellulare non viene interrotto. Risospendere le cellule in media completo MCDB-131 ad una concentrazione di 4 x 105 cellule/mL. Seme le cellule in sospensione su idrogeli togliendo prima i media con cui sono stati incubati nel caso degli idrogeli e quindi aggiungendo 1 mL di sospensione cellulare su ogni idrogel. 3. infezione di cellule endoteliali microvascolari umane con L. monocytogenes Preparazione anticipataNota: Preparare le seguenti soluzioni in anticipo. Streptomicina, cloramfenicolo e gentamicina scorte Preparare soluzioni di riserva di 50 mg/mL di streptomicina pesando 0,5 g di solfato di streptomicina e scioglierlo completamente in 10 mL di acqua ultrapura. Preparare soluzioni di riserva di 7,5 mg/mL di cloramfenicolo pesando 75 mg di cloramfenicolo e scioglierlo completamente in 10 mL di etanolo al 100%. Preparare soluzioni di riserva di 20 mg/mL di gentamicina pesando 0,2 g di solfato di gentamicina e scioglierlo completamente in 10 mL di acqua ultrapura. Filtro-sterilizzare tutte le soluzioni di riserva con un filtro per siringa da 0,2 µm e conservarli a-20 ° C per uso a lungo termine (1-2 mesi). Piastre di cervello cuore infusione (BHI) media e agar Individuare due boccette 1L e aggiungere un ancoretta magnetica all’interno di ciascuna beuta. Per i media BHI, aggiungere 37 g di polvere BHI in una boccetta e aggiungere acqua distillata fino a 1 L. Mix la soluzione vigorosamente posizionando il pallone su una piastra magnetica mescolare fino a quando la polvere si è sciolta. Per le piastre di agar BHI, aggiungere 37 g di polvere BHI e 15 g di granulato agar (Vedi Tabella materiali) nella seconda beuta e aggiungere acqua distillata fino a 1 L. Mix la soluzione vigorosamente posizionando il pallone su una piastra magnetica mescolare fino a quando la polvere si è sciolta. Avvitare i coperchi dei contenitori non troppo bene e autoclave le soluzioni utilizzando il liquido impostazione o secondo le specifiche dell’autoclave. Rimuovere la soluzione dall’autoclave, quindi raffreddare la soluzione di agar-BHI a 55 ° C. Se i media BHI nella beuta di 1L è mantenuto sterili, può essere utilizzato per fino a un mese. Per preparare i batteri piastre di agar-BHI, prima di aggiungere gli antibiotici, se del caso, il matraccio contenente BHI e agar (a seconda di ceppi batterici può essere coltivata). Brevemente mettere il pallone su una piastra magnetica per consentire la miscelazione rapida.Nota: Gli antibiotici usati qui sono specifici per i ceppi di Lm utilizzati, ma qualsiasi necessari antibiotici possono essere utilizzati in piastre di agar BHI. Abbiamo aggiunto la streptomicina ad una concentrazione di 200 µ g/mL e cloramfenicolo ad una concentrazione di 7,5 µ g/mL perché 10403S Lm ceppi sono resistenti a streptomicina. Questi ceppi sono stati coniugati con un plasmide contenente il cloramfenicolo acetiltransferasi open reading frame, quindi la resistenza al cloramfenicolo. Versare il composto in 10 cm polistirolo batteri piastre di coltura (circa 20 mL per piastra). Per sbarazzarsi di bolle, fiamma brevemente la superficie superiore delle piastre. Piastre di freschi durante la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, sigillare le piastre asciutte e conservarli a 4 ° C. Infezione di cellule endoteliali microvascolari umane con L. monocytogenes Tre giorni prima dell’infezione, striscia fuori il Lm sforzare per essere utilizzato da uno stock di glicerolo (conservato a-80 ° C) su una piastra di agar BHI contenente 7,5 µ g/mL di cloramfenicolo e 200 µ g/mL di streptomicina, se appropriato.Nota: Lo sforzo per essere striati fuori può essere un wild-type o mutanti, costitutivamente esprimendo la fluorescenza (per immunostaining che è stato utilizzato JAT1045) o esprimendo la fluorescenza sotto il promotore di ActA (per flusso cytometry o trazione microscopia a forza JAT983 o JAT985 sono stati utilizzati)22. Incubare le piastre a 37 ° C fino a colonie discreti sono formate (1-2 giorni). Il giorno prima dell’infezione, crescere la tensione desiderata durante la notte, scuotendolo a 150 giri/min a 30 ° C in media BHI con 7,5 µ g/mL di cloramfenicolo (se appropriato). Posto 5 mL di terreno BHI in una provetta conica per centrifuga 15 mL, aggiungere 7,5 µ g/mL di cloramfenicolo (se appropriato) e poi inoculare una singola Colonia dalla piastra di agar utilizzando una punta sterile 10 µ l. Il giorno successivo, appena prima dell’infezione, misurare la densità ottica della soluzione batteri a 600 nanometro (OD600) diluendo il campione 1:5; utilizzare una provetta contenente BHI singolarmente per servire come uno spazio vuoto. Diluire la cultura durante la notte per un OD600 di 0.1 e incubare, agitazione per 2 ore a 30 ° C, in media BHI con 7,5 µ g/mL di cloramfenicolo (se appropriato) per consentire ai batteri di raggiungere registro-fase crescita. Misurare il OD600 della soluzione batterica, che dovrebbe essere intorno a 0.2 – 0.3. Se il OD600 è superiore, diluirlo a 0.2 – 0.3 con BHI da solo. Prelevare 1 mL della soluzione batterica in un tubo del microcentrifuge. Rallentare per 4 min a 2.000 x g utilizzando una centrifuga a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di PBS di coltura del tessuto-grado, nella cappa di coltura del tessuto. Lavare i batteri due volte più di filatura li giù per 4 min a 2.000 x g e a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e risospendere i batteri in 1 mL di PBS. Preparare la miscela di infezione mescolando 10 o 50 µ l dei batteri risospesi in PBS con 1 mL di MCDB-131 multimediale completa per una molteplicità di infezione (MOI; cioè, il numero di batteri per ogni cellula ospite) di circa 50 batteri per cellula ospite o 10 batteri per cellula ospite. Rimuovere il supporto dai pozzetti delle piastre 24 pozzetti, attenzione a non disturbare l’idrogel o le cellule. Lavare le cellule 1 x con 1 mL di MCDB-131 versione media e quindi aggiungere 1 mL di batteri in ciascun pozzetto. Mantenere alcuni mix di infezione (almeno 100 µ l) per la determinazione di MOI (Vedi punto 3.3). Coprire la piastra con il suo coperchio e avvolgere le piastre con pellicola di polietilene alimentare per evitare perdite. Posizionare le piastre nella centrifuga e girare i campioni per 10 min a 200 x g per sincronizzare l’invasione. Spostare le piastre nell’incubatrice di coltura del tessuto e li Incubare 30 min a 37 ° C. Lavare i campioni 4 x con MCDB-131 versione media e spostarli nell’incubatrice di coltura del tessuto. Dopo altri 30 minuti, sostituire il supporto con supporti integrati con 20 µ g/mL di gentamicina. Determinazione della molteplicità di infezione (MOI) Durante l’incubazione di 30-min iniziale delle cellule dell’ospite con i batteri, preparare diluizioni seriali x10 del mix infezione per determinare il MOI. Effettuare diluizioni 10 volte mescolando 100 µ l della miscela infezione con 900 µ l di PBS 1X (diluizione 10-1 ). Quindi, mescolare 100 µ l della diluizione 10-1 con 900 µ l di PBS (diluizione 10-2 ). Continuare fino ad ottenuta una diluizione di 10-5 .Nota: Tutte le soluzioni devono essere mescolati bene prima diluendoli e puntali per pipette pulito fresco dovrebbero essere usati in ogni fase. Dopo aver effettuate le diluizioni, mettere 100 µ l del 10-2 – 10-5 diluizioni al centro delle piastre BHI/agar/cloramfenicolo/streptomicina (se appropriato). Rendere un divaricatore da una pipetta di vetro utilizzando fuoco per piegare la pipetta per creare un gancio. Immergere la pipetta in etanolo al 100% per la sterilizzazione e poi bruciare l’etanolo con una fiamma. Una volta raffreddato il divaricatore, diffondere le diluizioni batteriche in modo omogeneo sulle piastre a partire dalla diluizione 10-5 e lo spostamento per i mix più concentrati. Incubare le piastre capovolte a 37 ° C per 2 giorni. A seconda della densità di Colonia, determinare il numero di colonie del 10-3 e 10-4 o il 10-4 e 10-5 piastre di diluizione. Calcolare il MOI come segue:numero di colonie × fattore ÷ volume di diluizione iniziale aggiunto = numero di CFU per µ lnumero di CFU per ciascun volume × µ l di miscela di batteri per bene = numero di CFU per pozzettonumero di CFU per ben × volume di cellule per pozzetto = numero di batteri per cellaNota: CFU acronimo formanti colonie unità. Media il MOIs da due piastre per ottenere il finale MOIs. 4. flusso Cytometry per quantificare la rigidità di matrice extracellulare dipendente suscettibilità delle cellule dell’ospite all’infezione Pesare 5 mg di collagenasi e trasferirlo in una provetta conica per centrifuga 15 mL. Aggiungere 10 mL di tripsina-EDTA 0.25% e mescolare bene. 8 h post-infezione, rimuovere il supporto dai pozzetti della piastra 24 pozzetti e lavare i pozzetti 1 x con coltura tissutale PBS. Rimuovere il PBS dai pozzetti e aggiungere 200 µ l della miscela tripsina-EDTA/collagenasi ad ogni pozzetto. Posizionare questo nell’incubatore coltura tissutale per 10 minuti consentire il completo distacco delle cellule. Utilizzare una pipetta fresca per ciascun pozzetto e dispensare il mix su e giù 8x. Essere dolce in modo da non danneggiare le cellule. Aggiungere 200 µ l di pieno di media in ciascun pozzetto per neutralizzare la tripsina. Trasferire la soluzione di cella 400-µ l di ciascun pozzetto in una provetta polistirolo 5 mL con tappo filtro cella 35-µm (Vedi Tabella materiali). Analizzare le cellule di 10.000-20.000 per campione tramite flusso cytometry. Effettuare l’acquisizione di dati tramite citometria a flusso e determinare la percentuale delle cellule infettate ogni pozzetto utilizzando un software disponibile in commercio pertinente. Utilizzare il forward scatter vs side scatter grafici per la maggior parte della distribuzione dei conteggi delle cellule del cancello.Nota: Questo garantirà analisi di singole cellule ed eliminare i detriti o doppietti di cella o triplette. Misurare il segnale di fluorescenza da cellule non infetti di controllo e la popolazione delle cellule infettate escluse autofluorescenza del cancello. 5. Immunostaining dei batteri extracellulari, microscopia ed elaborazione di immagini Nota: Questo approccio è seguito per differenziare tra adesione batterica dipendente ECM-rigidità sulla superficie della cellula ospite contro batterica internalizzazione (invasione) all’interno dei padroni di casa. Figura 4 : Immunostaining di Lm-infettati HMEC-1 cellule che risiedono su idrogeli di rigidità variabile per differenziare l’adesione batterica contro invasione. Queste immagini mostrano un esempio rappresentativo di immunostaining differenziale risultati A. i nuclei cellulari (DAPI), B. tutti i batteri (GFP) e C. i batteri esterni (Alexa-546). Le cellule HMEC-1 sono stati che risiedono su un idrogel morbido 3-kPa. Le frecce puntano a batteri che hanno stati interiorizzati, quindi vengono visualizzati sul canale verde solo. Dati in D-F si riferiscono a N = 20 immagini catturate per le cellule HMEC-1 infette che risiedono su morbido 3-kPa e rigida 70-kPa idrogeli eVisualizza D. i batteri totali per nuclei; E. i batteri interiorizzati per nuclei; e F. l’efficienza di invasione (il rapporto tra batteri interiorizzati di batteri totali). Le barre orizzontali raffigurano media dei dati. Il P-value è stato calcolato con il test di Wilcoxon Rank Sum non parametrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 30 min dopo l’infezione, lavare le cellule HMEC-1 infettate con JAT1045 (Lm che costitutivamente esprime la proteina fluorescente verde (GFP)) 4 x con i media. Dopo il quarto lavaggio, mescolare 1 µ l di 1 mg/mL di colorante Hoechst con 1 mL di terreno completo MCDB-131 e aggiungerlo ad ogni pozzetto a macchiare i nuclei delle cellule. Posizionare le cellule nell’incubatore coltura tissutale per 10 min. Lavare le cellule 1 x con PBS. Loro difficoltà con fissativo non permeabilizing per differenziale immunostaining per 20 min a temperatura ambiente28.Nota: Il fissativo contiene saccarosio 0,32 M, 10 mM a pH MES 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA e 4% formaldeide (grado di microscopia elettronica). Lavare le cellule 1 x con PBS. Bloccare i campioni per 30 min con 5% di albumina di siero bovino (Vedi Tabella materiali) in PBS. Incubare i campioni per 1 h con un anti-Lmanticorpo primario (vedere Tabella materiali) diluito 1: 100 in PBS contenente 2% BSA. Lavare i campioni in PBS 3 x e poi li Incubare per 1 h con un AlexaFluor-546 anticorpo secondario goat-anti-rabbit (Vedi Tabella materiali) diluito 1: 250 in PBS contenente 2% BSA. Lavare i campioni 3 x in PBS. Conservare i campioni in 1 mL di PBS per l’imaging. Immagine e analizzare più di 1.000 cellule per condizione. Per l’imaging, utilizzare un microscopio a epifluorescenza invertito con una telecamera CCD (Vedi Tabella materiali) e un obiettivo di aria di aria piano fluorite con 0,6 apertura numerica (NA): 40x.Nota: L’alimentazione è impostata su 25% e il tempo di esposizione di 100 ms i filtri di microscopio utilizzati per mCherry sono 470/525 nm, per GFP 530/645 nm e per DAPI 395/460 nm, per l’eccitazione e di emissione rispettivamente. Il microscopio che abbiamo usato era controllato da un opensource microscopia software pacchetto29. Per differenziale immunostaining, contare tutti i batteri ‘verdi’ associati a singole celle come aderente. Contare i batteri che sono sia ‘verde’ e ‘rosso’ (a causa del legame dell’anticorpo) come non interiorizzato.Nota: Abbiamo identificato il numero di nuclei eseguendo uno script su misura e il software di CellC (Vedi Tabella materiali) per l’enumerazione dei batteri30. 6. microscopia a forza trazione multi-pozzetto e monostrato Stress microscopia Figura 5: cellule HMEC-1 Lm-infettati diminuire la grandezza delle forze di trazione che esercitano sul loro ECM durante l’infezione. Pannello A Mostra l’immagine di fase, B Mostra il campo di deformazione, C Mostra il campo di sforzo di trazione e D Mostra il campo di tensione intracellulare delle cellule HMEC-1 non infetti che risiedono su un idrogel di 20 kPa. Le barre di colore della deformazione mappe (µm), della trazione stress mappe (Pa) e del tensionamento intracellulare mappe (nNµm-1) vengono visualizzate nella parte superiore delle mappe di calore. Le colonne mostrano tre punti rappresentativi di tempo: 3, 8 e 18 h dopo l’infezione. E-H. Uguale come pannelli A-D , ma da cellule infettate con Lm presso un MOI di 300. Le immagini dei batteri (canale rosso) si sovrappongono le immagini di fase delle cellule. Registrazioni di TFM sono stati condotti da imaging pozzi multipli contemporaneamente. La dimensione della finestra per PIV era 32 pixel con una sovrapposizione di 16. La barra della scala è 32 µm. Questa figura è stata modificata da Bastounis e Theriot59. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Preparare gli idrogeli PA su una piastra a 24 pozzetti (Vedi punto 1). Seme HMEC-1 cellule (Vedi punto 2) e infettare i loro con JAT983 come descritto sopra (Vedi passo 3). Preparare un supporto live-microscopia completando L-15 di Leibovitz con 10% siero bovino fetale, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico e 1 idrocortisone μg/mL.Nota: Il L-15 contiene già 2 mM L-Glutammina, quindi non è necessario aggiungere extra come nel caso dei media MCDB-131. 4 h post-infezione (quando il JAT983 interiorizzate inizia con la dicitura), mescolare 1 μL di 1 mg/mL di colorante Hoechst con 1 mL di terreno completo L-15 e aggiungerlo ad ogni pozzetto a macchiare i nuclei delle cellule. Posizionare le cellule nell’incubatore coltura tissutale per 10 min e quindi sostituire in ogni pozzetto il supporto completo di L-15 con 1 mL di L-15 pieno di media completato con 20 µ g/mL di gentamicina. Coprire la piastra con il suo coperchio e posto in camera ambientale di un microscopio (Vedi Tabella materiali) equilibrato a 37 ˚ c.Nota: Per l’imaging, utilizzare un microscopio a epifluorescenza invertito con una telecamera CCD (Vedi Tabella materiali) e a 40 X obiettivo di aria di aria piano fluorite con 0,6 na Acquisire immagini time-lapse multi-canale delle perline fluorescenti e i batteri fluorescenti e immagini di contrasto di fase delle cellule dell’ospite, ogni 10 min per 4 e 12 h.Nota: Per l’imaging, il potere è stato impostato al 25% e il tempo di esposizione di 100 ms i filtri di microscopio (eccitazione/emissione) utilizzati per mCherry e GFP sono 470/525 nm e 530/645 nm rispettivamente. Al termine della registrazione, aggiungere 500 µ l di 10% sodio dodecil solfato (SDS) in acqua in ciascuno dei pozzetti.Nota: Le celle verranno scollegate dall’idrogel e l’idrogel tornerà allo stato iniziale indeformato poiché è elastico. Acquisire un’immagine dell’idrogel e utilizzarlo come immagine indeformata di riferimento. Determinare la deformazione bidimensionale dell’idrogel in ogni istante di tempo utilizzando particle image velocimetry (PIV)31, confrontando ogni immagine della serie time-lapse con l’immagine di riferimento dell’idrogel indeformata. Utilizzare le dimensioni finestra appropriata e si sovrappongono a seconda dell’esperimento.Nota: Abbiamo usato il windows di 32 pixel con una sovrapposizione di 16 pixel. Calcolare le sollecitazioni di trazione 2D che cellule esercitano su idrogel come descritto altrove32,33. Calcolare la tensione monostrato dalle sollecitazioni di trazione come precedentemente descritto34 risolvendo le equazioni di equilibrio meccanico per una piastra sottile elastica soggetto alle forze di reazione creato dall’idrogel di PA su monostrato, che sono di un segno per le sollecitazioni di trazione misurata opposto.Nota: Vedere materiale supplementare 1. 7. quantitativa microscopia time-lapse per valutare extracellulari-matrix-rigidità dipendente L. monocytogenes diffusione attraverso cellule endoteliali Figura 6: dati di time-lapse microscopia quantitativa di diffusione Lm attraverso strati monomolecolari HMEC-1 seminato su substrati con rigidità 3-kPa e 70-kPa. R. questo pannello mostra ancora immagini da due fuochi di infezione rappresentativo a 0, 200, 400 e 600 min. Il canale di fase raffigura monostrati di cellule HMEC-1, e il canale rosso raffigura Lm intracellulare (vedere il punto 7 del protocollo). B. questo pannello mostra l’area della struttura convessa che comprende il focus di infezione tracciato come funzione del tempo. L’area di messa a fuoco della condizione 3-kPa (rosso) cresce più velocemente di quello del 70-kPa (verde). C. questo pannello mostra che la distanza radiale dal centro verso il bordo del focus infezione tracciate come funzione del tempo per rappresentante focolai di infezione cresce negli strati monomolecolari HMEC-1 seminati su substrati di PA di 3-kPa (rosso) e rigidità 70-kPa (verde). La velocità radiale (dr/dt) è costante per la condizione 3-kPa, ma bifase per la condizione di 70-kPa. D. questi dati mostrano la velocità radiale per i primi 200 min di dieci focolai di infezione indipendente. Il rosso (3-kPa) e verde (70-kPa) punti dati raffigurano le piste dei due fuochi descritti nei pannelli precedenti. Le barre orizzontali raffigurano media dei dati. Il P-value è stato calcolato con il test di Wilcoxon Rank Sum non parametrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Preparare gli idrogeli PA su una piastra a 24 pozzetti (Vedi punto 1), cellule HMEC-1 (Vedi punto 2) del seme e crescere durante la notte JAT983 culture come descritto in precedenza (Vedi passo 3). Il giorno di infezione, preparare il mix di infezione con 10 µ l di pellet batterica per mL di multimediale full MCDB-131. Con attenzione rimuovere il supporto dai pozzetti delle piastre 24 pozzetti e aggiungere 1,9 mL di media completo MCDB-131 e 0,1 mL della miscela batterica in ciascun pozzetto.Nota: Il MOI più basso usato per questo test è necessario analizzare gli eventi di diffusione che a partire da un singolo batterio invade una cellula ospite. Coprire la piastra con il suo coperchio e sigillare con un involucro di plastica per evitare perdite. Posizionare le piastre nella centrifuga e girare i campioni per 10 min a 200 x g per sincronizzare l’invasione. Spostare le piastre nell’incubatrice di coltura del tessuto e li Incubare per 5 min. Lavare i campioni 4 x con media e spostarli nell’incubatore di coltura del tessuto. Dopo altri 5-7 min, sostituire il supporto con supporti integrati con 20 µ g/mL di gentamicina. Incubare la piastra nell’incubatore per un extra 5 h per consentire il promotore di actA attivare e guidare l’espressione del mTagRFP open reading frame35. Preparare un supporto live-microscopia completando L-15 di Leibovitz con 10% siero bovino fetale, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico e 1 µ g/mL dell’idrocortisone.Nota: Il L-15 contiene già 2 mM L-Glutammina, quindi non è necessario aggiungere extra come nel caso dei media MCDB-131. Mescolare 1 μL di 1 mg/mL Hoechst tingere con 1 mL di terreno completo L-15 e aggiungerlo ad ogni pozzetto a macchiare i nuclei delle cellule. Posizionare le cellule nell’incubatore coltura tissutale per 10 min e quindi sostituire in ogni pozzetto il supporto completo di L-15 con 1 mL di L-15 pieno di media completato con 20 µ g/mL di gentamicina. Coprire la piastra con il suo coperchio e posto in camera ambientale di un microscopio (Vedi Tabella materiali) equilibrato a 37 ˚ c.Nota: Per l’imaging, un microscopio a epifluorescenza invertito è stato utilizzato con una telecamera CCD (Vedi Tabella materiali) e un 20x obiettivo di aria di aria piano fluorite con 0,75 na Il potere è stato impostato al 50% e il tempo di esposizione a 50 ms. I filtri di microscopio utilizzati per mCherry sono 470/525 nm per l’eccitazione e di emissione rispettivamente. Immagine più posizioni ogni 5 min utilizzando una funzione di autofocus per monitorare come Lm diffusione attraverso gli strati monomolecolari HMEC-1 seminate su variando la rigidità idrogeli.Nota: L-15 è tamponato con HEPES, quindi non è necessario l’utilizzo di CO2 durante l’imaging.

Representative Results

Sensibilità di rigidità-dipendente di ECM delle cellule HMEC-1 all’infezione di Lm:PA idrogeli di rigidità variabile, tutti superficie-rivestito con collagene I, sono stati costruiti sulle piastre di vetro multi-pozzetto inferiore come descritto nella fase 1 del protocollo (Vedi Figura 1). AFM sono state effettuate per confermare la rigidezza esatta degli idrogeli, come descritto in precedenza26,27 (Vedi Figura 2). Studi precedenti hanno mostrato che la conformità locale della membrana basale delle cellule endoteliali può variare da 1 kPa (ad es., tessuto cerebrale) a 70 kPa (ad es., aorta)36,37,38, 39 , 40. Pertanto, abbiamo scelto di testare l’infezione delle cellule HMEC-1 che risiedono su matrici con la rigidità seguente: 0,6 kPa, 3 kPa, kPa 20 e 70 kPa. Per ogni rigidità di idrogel, sei idrogeli furono fabbricati per valutare la riproducibilità dei risultati. Citometria a flusso è stato utilizzato per valutare la suscettibilità di rigidità-dipendente di ECM di cellule HMEC-1 all’infezione Lm (Vedi Figura 3). Cellule HMEC-1 sono state infettate con un ceppo di Lm (JAT985) che esprime un marcatore fluorescente dopo internalizzazione (actAp::mTagRFP), che permette la rilevazione di batteri intracellulari soltanto (Vedi figure 1 L – 1N). JAT985 manca anche ActA, disabilitando i batteri da diffusione da cella a cella, poiché ActA è necessario per la formazione di code di cometa di actina e successiva diffusione batterica. 7 – post-l’infezione 8 h, l’infezione delle cellule HMEC-1 è stato valutato mediante citometria a flusso. Per garantire l’analisi delle singole cellule, la maggior parte della distribuzione dei conteggi delle cellule era stata eliminata utilizzando l’in avanti rispetto al grafico a dispersione laterale, e poi una seconda fase di gating è stata effettuata per escludere le celle che presentano autofluorescenza (Vedi figure 3A – 3C ). I risultati preliminari, raffigurati in Figura 3 dimostrano che l’infezione di HMEC-1 con Lm è circa due volte maggiore per cellule HMEC-1 che risiedono sul rigida 70 kPa idrogeli rispetto alle cellule che risiedono sui morbido idrogeli kPa 0,6 (vedere figure 3B – 3D). la suscettibilità di infezione Lm aumentata delle cellule HMEC-1 che risiedono su rigida rispetto alle matrici morbidi potrebbe essere dovuto a: 1. aumentata aderenza Lm HMEC-1; 2. maggiore invasione di Lm in HMEC-1; o 3. entrambi il co-avvenimento sopra. Per verificare quale ipotesi detiene, cellule HMEC-1 sono state seminate su soft (3 kPa) e rigida (70 kPa) idrogeli e infettate con costitutivamente GFP esprimendo Lm (Vedi figure 4A – 4C). I campioni sono stati risolti poco dopo l’infezione ed i batteri esterni (aderenti) erano macchiati con gli anticorpi. Usando la microscopia quantitativa, abbiamo scoperto che ci sono significativamente più batteri aderendo al HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono sul rigido rispetto al gel molli (Vedi Figura 4D). Coerenti con i dati di citometria a flusso, ci sono significativamente più batteri interiorizzate di HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono sul rigido rispetto al gel molli (Vedi Figura 4E). Tuttavia, l’efficienza di invasione (batteri interiorizzato/numero totale di batteri) di Lm in cellule HMEC-1 è simile, indipendentemente dalla rigidità del substrato (Vedi Figura 4F). Microscopia di forza di trazione delle cellule HMEC-1 Lm-infettati:L’infezione delle cellule HMEC-1 LM potrebbe alterare la biomeccanica delle cellule ospiti infetti, tra cui la forza di attaccamento alla loro ECM o di ogni altro, che interessano l’integrità della barriera. Abbiamo cercato di valutare se questo potrebbe essere il caso mediante microscopia a forza trazione32 per calcolare le forze di trazione di cella-ECM e monostrato Stress microscopia41 per calcolare le forze tensionale intracellulare. Figura 5 raffigura mappe del campo di deformazione, campo di sforzo di trazione e campo di tensione intracellulare delle cellule HMEC-1 residente su 20-kPa idrogeli a tempi diversi punti post-infezione. Figure 5A – 5D fanno riferimento a celle di controllo non infetto HMEC-1 mentre figure 5E – 5h consultare HMEC-1 cellule infettate con Lm ad una molteplicità di infezione pari a 300/cellula dei batteri. Questo lavoro preliminare suggerisce che infettate cellule HMEC-1 riducono la grandezza della loro cella-ECM e sottolinea intracellulare nel corso di un’infezione con Lm, considerando che non è osservato per le cellule di controllo non infetto. Diffusione a ECM rigidità-dipendente Lm attraverso strati monomolecolari HMEC-1:Time-lapse microscopia è stata usata per studiare l’effetto rigidità matrice ha sulla diffusione di Lm attraverso strati monomolecolari HMEC-1. Come Lm si diffonde attraverso il monostrato, i batteri creano un focus di infezione che cresce in funzione del tempo (Vedi Figura 6A e Video figure 1 e 2). L’area di messa a fuoco l’infezione è stata misurata tracciando un guscio convesso, il più piccolo poligono convesso che racchiude un insieme di punti, intorno i batteri42. Non esiste alcuna metrica standard nel settore per misurare l’efficienza della diffusione di cellula–cellula di L. monocytogenes attraverso un monostrato di cellule dell’ospite. Per valutare l’efficienza di diffusione, alcuni hanno contato il numero di cellule dell’ospite in un focus di infezione41, e altri hanno confini disegnati manualmente intorno al gruppo di infezione host cellule43. Abbiamo scelto disegnare un poligono convesso intorno i batteri, perché è un processo automatizzato, coerente e computazionalmente economico per misurare l’efficienza della diffusione di L. monocytogenes . Così facendo, abbiamo trovato una lieve diminuzione dell’area focus di infezione nelle cellule HMEC-1 seminate su 70 kPa idrogel rispetto a quelle seminate su 3 matrici di kPa (Vedi Figura 6B e Video figure 1 e 2). Per determinare il tasso di crescita del focus di infezione, la distanza radiale è stata tracciata come funzione del tempo prendendo la radice quadrata dell’area di messa a fuoco l’infezione e questo dividendo da pi. Questa trasformazione matematica presuppone che la forma della messa a fuoco infezione è approssimativamente circolare44. Per misurare la velocità della crescita messa a fuoco, è stato misurato il tasso di cambiamento (cioè, la pendenza) della distanza radiale per entrambi matrici 3 e 70 kPa. Questo approccio chiarito che il focus di infezione è cresciuto più velocemente e monotona in cellule HMEC-1 seminate su matrici 3-kPa. Tuttavia, la messa a fuoco è cresciuto significativamente più lento (primo 200 min) e leggermente più lento (200-600 min) in cellule seminate su matrici 70-kPa (Vedi Figura 6C). Infatti, l’analisi di ulteriori dati ha confermato che il focus di infezione è cresciuto, in media, due volte più lento in matrici 70-kPa, soprattutto durante il primo min 200 (Vedi Figura 6D). Figura 3 : ECM rigidità-dipendente suscettibilità delle cellule HMEC-1 per invasione di Lm misurata mediante citometria a flusso .  Cellule HMEC-1 sono state infettate con Lm (JAT985) e l’infezione è stata analizzata tramite flusso cytometry. A. questo pannello mostra un lato contro dispersione avanti per rappresentante cellule HMEC-1 provenienti da un singolo pozzo. La distribuzione di massa delle cellule è stata selezionata tramite gating per escludere detriti (a sinistra) e delle cellule doppiette o triplette (a destra). B. questo grafico mostra un istogramma del logaritmo dell’intensità di fluorescenza Lm per cella per HMEC-1 ha placcato il morbido 0,6 kPa. C. questo grafico mostra un istogramma del logaritmo dell’intensità di fluorescenza Lm per cella per HMEC-1 placcato sulla rigida 70 kPa idrogeli. Gli istogrammi per N = 4-6 ripetizioni sono mostrati in diversi colori. Istogramma delle cellule controllo non infetto è viola. La porta utilizzata per definire che cosa è infetto è mostrata in rosso. Il MOI è 100 e l’infezione è stata valutata 8 h post-infezione. D. dati mostrano la percentuale delle cellule infettate HMEC-1 versus idrogel rigidità (N = 5). Le barre orizzontali raffigurano media dei dati. Il P-value è stato calcolato con il test di Wilcoxon Rank Sum non parametrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Video Figura 1: diffusione intracellulare LM (canale rosso) attraverso un monostrato di cellule HMEC-1 (fase) seminate su un substrato di 3-kPa. Le cellule erano imaged in media L-15 di Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL di gentamicina) dentro una camera ambientale equilibrata a 37 ˚ c. Le immagini sono stati raccolti ogni 5 min. La velocità è 15 fotogrammi/s. per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.) Video Figura 2: diffusione di Lm intracellulare (canale rosso) attraverso un monostrato di cellule HMEC-1 (fase) seminate su un substrato di 70-kPa. Le cellule erano imaged in media L-15 di Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL di gentamicina) dentro una camera ambientale equilibrata a 37 ° C. Le immagini sono stati raccolti ogni 5 min. La velocità è 15 fotogrammi/s. per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.) Modulo di Young (E, kPa) % Di acrilammide (dal 40% delle scorte) Bisacrylamide % (dal 2% delle scorte) 0.6 3 0,045 3 5 0,075 10 10 0,075 20 8 0,195 70 10 0.45 Tabella 1. Composizione di idrogel di poliacrilamide (PA) di diversa rigidezza. In questa tabella, la percentuale di soluzione stock 40% di acrilammide e la percentuale di stock 2% bis-acrilammide soluzione per raggiungere un determinato rigidità (modulo di Young, E) sono indicati in colonne diverse. Materiale supplementare 1. Calcolo della tensione intracellulare da sollecitazioni di trazione calcolata. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Le cellule possono percepire una varietà di stimoli ambientali fisici, che possono influenzare non solo la morfologia delle cellule, ma anche la loro attività di espressione e proteina gene, influenzando così critico cella funzioni e comportamenti45,46. La rigidità della ECM delle cellule è sempre più apprezzata come un importante modulatore della motilità cellulare, differenziamento, proliferazione e in definitiva delle cellule destino47,48,49. Anche se ci sono stati molti gli avanzamenti recenti nella comprensione la complessa interazione biomeccanica tra cellule e loro ECM, piccolo è conosciuto circa come ambientale rigidità colpisce la suscettibilità delle cellule all’infezione batterica. Per facilitare tali studi, abbiamo sviluppato questa analisi multi-pozzetto Novella basata sulla fabbricazione consolidata di idrogel di poliacrilamide di rigidità sintonizzabile che è compatibile con infezione saggi50. Tradizionalmente, un’infezione batterica delle cellule nella coltura del tessuto è stata studiata su vetro o polistirolo superfici che sono circa 1-3 ordini di grandezza più rigidi di ECM naturale di più aderente celle8,51. Il test descritto qui apre nuove autostrade, consentendo lo studio delle interazioni batterio-ospite in un regime di rigidità ambientale fisiologicamente rilevanti.

Per la prova di concetto del saggio presentato, cellule HMEC-1 sono stati scelti come modello cellule dell’ospite aderente e Lm come un agente patogeno batterico di modello. Tuttavia, il dosaggio può essere esteso per ulteriori studi, se modificate in modo appropriato. Tali studi possono coinvolgere l’infezione di tipi cellulari diversi mammifero ospite aderente da ulteriori agenti patogeni, come batteri e virus. Per questo particolare test, gel erano proteine rivestite con collagene I, ma a seconda del tipo di cella di host, è possibile utilizzare un rivestimento-diverso ECM della proteina, come laminina o fibronectina, per facilitare l’attaccamento di cellule dell’ospite di interesse sull’idrogel 52. un’ulteriore considerazione che dipende dal tipo di cellula ospite è la gamma di rigidità di idrogel per essere studiato. La gamma di rigidità dovrebbe dipendere da ciò che è fisiologicamente rilevante per il tipo di cella di host specifico e quanto bene che ospitano si attacca formando uno strato monomolecolare ad un rigidità dato idrogel. Allo stesso modo, a seconda del patogeno di modello desiderato per essere esaminato, lievi modifiche potrebbe essere necessario essere implementato su infezione dosaggio descritto nel presente documento.

L’innovazione del dosaggio rispetto ai metodi precedenti per produzione poliacrilammide idrogeli24,50,53 si trova in determinate caratteristiche uniche integrato con il test proposto l’infezione. In primo luogo, nel caso degli idrogeli è costruite su piastre inferiori di vetro multi-pozzetto, che permette la proiezione di più condizioni contemporaneamente, nonché l’automazione di alcune procedure. Monitoraggio condizioni multiple allo stesso tempo o esaminando più repliche è cruciale poiché il risultato di tale approccio può essere influenzato da fattori quali il passaggio di cella di host e il numero preciso di batteri aggiunta per infettare i padroni di casa, che spesso cambiano tra esperimenti indipendenti. Un’ulteriore caratteristica unica di questo test è che nel caso degli idrogeli hanno un’altezza di circa 40 µm, che è abbastanza sottile per l’immagine utilizza la microscopia convenzionale. Abbiamo mostrato che possiamo eseguire con successo cellule vive microscopia e fissazione delle cellule sia immunostaining seguita da formazione immagine, senza introdurre la fluorescenza di fondo alto. Infine, nel caso degli idrogeli è costituiti da due strati, con quella superiore, avendo incorporato microsfere fluorescenti, confinati in un unico piano focale. Questo attributo assicura che non ci sarà nessuna luce di out-of-focus interferire durante l’imaging. La presenza delle perline consente sia l’esame della topografia superficiale dei gel per garantire che essi siano uniformi e migliora le prestazioni del TFM e MSM24,32,41. Con TFM e MSM, è possibile calcolare le forze cella-ECM e cellula-cellula rispettivamente delle cellule che si trovano in diverse matrici di rigidezza. Utilizzando questa analisi Novella, è possibile fare tali misurazioni di forze fisiche confrontando simultaneamente sia il contributo di rigidità dell’ambiente e dell’infezione. Seguendo tale approccio, l’infezione di effetto ha sulla cellula ospite meccanica durante tutto il corso può essere determinato. Inoltre, l’evoluzione delle sollecitazioni intracellulare delle cellule può essere calcolata usando MSM e può essere utilizzato come una misura dell’integrità barriera dello strato monomolecolare. Infine, data la natura multi-pozzetto del test, è possibile contemporaneamente introdurre perturbazioni farmacologiche e genetiche con un’infezione batterica, di indagare in modo più approfondito la complessa interazione tra host cella meccanica ed infezione.

Una limitazione intrinseca della tecnica si trova nella rigidità del substrato di effetto potrebbe avere il tasso di proliferazione delle cellule. In genere, nelle analisi di infezione, dobbiamo far sì che la densità delle cellule ospite in condizioni diverse è lo stesso. Ecco perché la densità delle cellule di per sé può avere un effetto sulla suscettibilità dei padroni di casa all’infezione. Le cellule HMEC-1 che sono state usate come cellule dell’ospite non mostrano una differenza significativa nel loro numero quando seminato per 24 h nel caso degli idrogeli. Tuttavia, diversi tipi di cellule potrebbero esibire proliferazione differenziale, in base alla rigidità di idrogel, che può influenzare gli studi di infezione. Allo stesso modo, bias di infezione possono sorgere quando le cellule non formano monostrati o non fissare bene su idrogeli, come si verifica quando alcuni tipi di cellule sono seminati su matrici molto morbidi (ad esempio, le cellule endoteliali del cordone ombelicale umano o rene canino Madin-Darby cellule epiteliali seminate su 0.6 kPa idrogeli54,55). Per quanto riguardano i patogeni, alcuni batteri (ad es., Borrelia burdgorferi) possono attaccarsi a ospitare le cellule e li invade, ma può anche trasmigrano attraverso di loro56. Non abbiamo ancora testato se questo test avrebbe funzionato per gli studi di trasmigrazione di agente patogeno, ma sembra possibile, poiché gli studi precedenti sui neutrofili trasmigra seminate su PA idrogeli le cellule endoteliali sono stati documentati per lavorare con successo57. Ci sono stati un sacco di studi condotti che Mostra come per la fabbricazione di idrogel di poliacrilamide di un determinato modulo di Young mescolando le concentrazioni adeguate di acrilammide e bis-acrilammide24,25,26 ,27. Tuttavia, soprattutto quando si desideri eseguire TFM esperimenti sulle cellule che risiedono su idrogeli di rigidità variabile, è fondamentale per confermare la rigidità prevista di idrogeli mediante AFM o altre tecniche di rientro58. Lievi scostamenti dal valore atteso possono verificarsi a causa di un diverso solvente utilizzato o una soluzione stock di acrilammide invecchiato, o dai modi AFM misure sono eseguite (ad esempio, la forma della punta dell’AFM). Infine, l’approccio presentato qui è basato sulla semina di cellule dell’ospite su matrici 2D, che possono differire da uno scenario 3D più realistico e fisiologicamente rilevante. Tuttavia, produzione gel 3D con rigidità sintonizzabile, li semina con cellule dell’ospite e quindi infettandoli con agenti patogeni, ancora comprende talune difficoltà tecniche. Tuttavia, prevediamo che nel prossimo futuro saremo in grado di estendere l’analisi corrente per lo studio di infezione in un ambiente 3D.

Per riassumere, il protocollo descritto unitamente ai risultati preliminari forniscono la prova che questa analisi novella può diventare uno strumento estremamente utile per studiare l’infezione della cellula ospite aderente con batteri patogeni in modo quantitativo e in modo molto più ambiente fisiologicamente rilevanti rispetto precedentemente esaminati. Il potere di fabbricare poliacrilammide idrogeli nell’impostazione proposta sta nel fatto che il dosaggio è compatibile con le prestazioni di più tecniche quali la citometria a flusso, immunostaining seguita da microscopia chiara e la microscopia di forza di trazione. Il dosaggio può essere utilizzato per gli studi che coinvolgono l’infezione di tipi cellulari diversi host aderente da agenti patogeni, che prevediamo avrà un impatto significativo in entrambi dipanando le strategie con cui gli agenti patogeni infettano padroni di casa e nel facilitare lo sviluppo di interventi terapeutici contro le infezioni.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

I nostri ringraziamenti a M. piè di pagina, R. Lamasón, M. Rengaranjan e membri del Theriot Lab per le loro discussioni e supporto sperimentale. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), la compagnia di Gilliam HHMI per Advanced Studio (PoE), la Stanford Graduate Fellowship (PoE) e l’American Heart Association (E.E.B.). Citometria a flusso è stata eseguita presso la Stanford Shared FACS Facility.

Materials

Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate – 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Vacuum chamber/degasser Belart 42025 37˚C and 5% CO2
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/
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Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).
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