Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.
Rigidité de la matrice extracellulaire comprend l’une des multiples stimuli mécaniques environnementales qui sont bien connues pour influencer le comportement cellulaire, la fonction et sort en général. Bien que les réponses des types de cellules adhérentes plus en plus à la rigidité de la matrice ont été caractérisés, comment adhérentes la sensibilité des cellules à une infection bactérienne dépend de la rigidité de la matrice est largement inconnue, comme c’est l’effet d’une infection bactérienne sur la biomécanique des cellules hôtes. Nous émettons l’hypothèse que la sensibilité des cellules endothéliales de l’hôte à une infection bactérienne dépend de la rigidité de la matrice où se trouvent ces cellules, et que les cellules de l’infection de l’hôte avec des bactéries va changer leur biomécanique. Pour tester ces deux hypothèses, les cellules endothéliales ont été utilisés comme hôtes de modèle et de Listeria monocytogenes comme un pathogène de modèle. En mettant au point un test de nouveaux puits multiples format, nous montrons que l’effet de la rigidité de la matrice sur l’infection des cellules endothéliales par L. monocytogenes peut être évaluée quantitativement par cytométrie en flux et immunostaining suivie par microscopie. En outre, à l’aide de la microscopie de force de traction, l’effet de L. monocytogenes infection sur la biomécanique de cellules endothéliales hôte peut être étudié. La méthode proposée permet l’analyse de l’effet de la mécanique des tissus sur une infection bactérienne de cellules adhérentes, qui est une étape cruciale vers la compréhension des interactions entre les cellules, leur matrice extracellulaire, biomécaniques et bactéries pathogènes. Cette méthode est également applicable à une grande variété d’autres types d’études sur la biomécanique de la cellule et la réponse à la rigidité du substrat où il est important d’être capable d’effectuer de nombreuses répétitions en parallèle dans chaque expérience.
Les cellules dans les tissus animaux plus sont généralement adhérentes, attachant une fois aux cellules voisines et à leur matrice extracellulaire (ECM). L’ancrage des cellules à leur ECM est critique pour de nombreux processus cellulaires, allant de la motilité cellulaire à la cellule de survie et la prolifération de1,2. Ancrage cellulaire à l’ECM dépend de la composition de l’ECM et la rigidité. Les cellules répondent à l’évolution de ce dernier par dynamiquement réorganisant leur cytosquelette, adhérences ECM-cellule et cellule-cellule, qui à son tour gravement altérer cellule biomécanique et fonctions3,4,5,6 . Rigidité de l’ECM peut varier dans l’espace (p. ex., localisation anatomique), dans le temps (i.e., vieillissement) et dans les processus physiopathologiques (p. ex., artériosclérose, cancer, infections, etc.). Par exemple, il est largement admis qu’endothélial cellules résidant sur plus rigide-par rapport aux plus doux-matrices exercer des efforts accrus pour leur ECM et les uns aux autres et pièce accrue la motilité et la prolifération7,8. De même, fibroblastes résidant sur des matrices plus rigides donnent des forces contractiles à leur ECM et montrent une augmentation de la prolifération, la motilité et ECM production9,10,11. Bien que la mécanique cellulaire et réponse à la rigidité de l’ECM ont été largement étudiés pour divers types de cellules, la relation entre les cellules de l’hôte adhérentes, la rigidité de leur ECM et infections bactériennes est encore largement inconnue.
Afin d’étudier le rôle de la rigidité de la ECM en interactions entre cellules de bactérie-hôte, L. monocytogenes (Lm) a été choisi comme l’agent pathogène de modèle. LM est une bactérie ubiquiste de toxi-infection alimentaire qui peut provoquer une infection systémique dans une grande variété d’hôtes mammifères. Ce pathogène intracellulaire facultatif peut se déplacer de l’épithélium intestinal, à des organes éloignés, en parcourant les différents types d’endothelia vasculaire. S’il viole la barrière hémato – encéphalique, Lm peut causer la méningite, et lorsqu’il traverse la barrière placentaire, il peut provoquer un avortement spontané12,13. LM peut infecter les types de cellules hôtes différentes et peut le faire en utilisant des stratégies distinctes de pathogènes. Infection de LM a été étudiée principalement dans le cadre des cellules épithéliales, bien que beaucoup moins sait-on comment Lm peut infecter et dérivation de cellules endothéliales tapissant la lumière des vaisseaux sanguins14,15,16. En outre, il est encore largement inconnu comment la rigidité de l’ECM où résident les cellules endothéliales module capacité de Lm à envahir ces cellules de l’hôte et à ensuite propagée. LM et plusieurs espèces bactériennes supplémentaires (c.-à-d., Rickettsia parkeri) Profitez de l’accueil des cellules qu’ils infectent à la fois envahissent dans leur cytoplasme et facilitent la diffusion de cellule-à17 , le cytosquelette d’actine , 18 , 19. ils y parvenir par le biais de l’expression des protéines qui leur permettent d’intervenir avec les voies de polymérisation de l’actine hôte et à produire les queues de comète d’actine qui facilitent leur propulsion avant16,20. À la suite de l’infection, cytosquelette d’actine de la cellule de l’hôte a besoin de réorganiser dynamiquement dans une manière qui n’est pas encore complètement caractérisée, susceptibles d’influer sur la biomécanique des cellules hôtes y compris les forces physiques qu’elles exercent sur leur ECM et sur chaque autres. Afin d’examiner ces processus, les cellules endothéliales microvasculaires humaines (CEMH-1) ont été choisis comme cellules hôtes modèle pour trois raisons : 1. les cellules endothéliales sont connus pour être très mécanosensibles car ils sont constamment exposés à divers indices physiques21; 2. les stratégies que LM emploie pour infecter les cellules endothéliales sont encore largement inconnus22; et 3. HMEC-1 sont une lignée de cellules immortalisées et peuvent, par conséquent, être facilement cultivées et soumis à des manipulations génétiques.
Infection bactérienne de cellules de l’hôte a surtout été étudiée in vitro en ensemençant des cellules sur verre ou polystyrène substrats qui sont nettement plus rigides que l’ECM physiologique de la plupart de cellules12,14,23. D’examiner l’infection de cellules ensemencées sur une matrice dont la raideur est physiologiquement pertinente et d’élucider le rôle de rigidité ECM sur l’infection des cellules de bactéries pathogènes, nous avons suivi une approche innovante fondée sur la fabrication maigre polyacrylamide incorporé faisant hydrogels de rigidité accordable sur plaques multipuits. La nouveauté de l’approche proposée est qu’il permet de contrôler plusieurs conditions en même temps en raison de son format multipuit et qu’elle est compatible avec des techniques multiples en raison de la manière particulière que les substrats sont construits. Cellules HMEC-1 ont été ensemencées sur ces protéines-enduit hydrogels et puis infectés par différentes souches de Lm qui deviennent fluorescents après internalisation ou sont constitutivement fluorescent. Le rôle de rigidité ECM sur la susceptibilité de l’infection des cellules-hôtes HMEC-1 a été évalué par cytométrie en flux. En outre, immunocoloration et fluorescence microscopy servaient à faire la différence entre bactéries adhérentes et intériorisées. Enfin, la microscopie de Force de Traction (TFM) a été effectué avec succès pour caractériser l’effet de l’infection de Lm sur les contraintes de traction que les cellules endothéliales hôte exercent sur leurs matrices au cours de l’infection. L’essai présenté peut être facilement modifié pour permettre plus amples études sur l’effet de la rigidité de l’ECM sur la susceptibilité de l’infection des cellules adhérentes à l’aide de différentes lignées cellulaires ou agents pathogènes.
Les cellules peuvent détecter une variété de signaux environnementaux physiques, ce qui peut affecter non seulement la morphologie des cellules, mais aussi leur expression et protéine activité génétique, affectant ainsi la cellule critique des fonctions et des comportements de45,46. La rigidité de l’ECM de cellules est plus en plus appréciée comme modulateur important de motilité cellulaire, différenciation, prolifération et finalement cellule sort47,48,49. Bien qu’il y a eu beaucoup de progrès récents dans la compréhension de l’interaction biomécanique complexe entre les cellules et leur ECM, peu est connu sur la rigidité environnementale affecte la sensibilité des cellules aux infections bactériennes. Pour faciliter ces études, nous avons développé ce nouveau dosage multipuit basé sur la fabrication bien établie de polyacrylamide hydrogels de rigidité ajustable qui est compatible avec une infection dosages50. Traditionnellement, une infection bactérienne de cellules en culture de tissus a été étudiée sur verre ou polystyrène qui sont environ 1 à 3 ordres de grandeur plus rigides que l’ECM naturel des plus adhérentes cellules8,51. L’essai décrit ici ouvre des nouvelles routes en permettant l’étude des interactions hôte-bactéries dans un régime de rigidité environnement physiologiquement pertinents.
Pour preuve de concept de l’analyse présentée, cellules HMEC-1 ont été choisis comme modèle hôte adhérentes cellules et Lm comme un pathogène bactérien de modèle. Cependant, l’essai peut être prolongée pour d’autres études si réduites en conséquence. Ces études peuvent impliquer infection de types cellulaires différents mammifère hôte adhérentes par des agents pathogènes supplémentaires, y compris les bactéries et les virus. Pour ce test particulier, gels étaient protéine-enduit avec collagène I, mais selon le type de cellule hôte, il est possible d’utiliser un revêtement-différent ECM protéines, telles que la fibronectine, laminine ou de faciliter la fixation des cellules hôte d’intérêt sur l’hydrogel 52. une autre considération qui dépend du type de cellule hôte est la gamme de rigidité d’hydrogel à étudier. La gamme de rigidité devrait dépendre de ce qui est physiologiquement approprié pour le type de cellule hôte spécifique et comment bien cet hôte s’attache à former une monocouche à un hydrogel de raideur donnée. De même, selon l’agent pathogène modèle désiré pour être examiné, légères modifications pouvez être amené à mettre en œuvre pour le dosage d’infection décrit ci-après.
L’innovation du dosage par rapport aux méthodes précédentes pour fabrication de polyacrylamide hydrogels24,50,53 réside dans certaines caractéristiques uniques intégrés dans l’analyse proposée de l’infection. Tout d’abord, les hydrogels sont construites sur des plaques de fond verre multipuits, qui permet la projection de plusieurs conditions en même temps ainsi que l’automatisation de certaines procédures. Surveillance des conditions multiples au même moment ou examen multiple replications est cruciale étant donné que le résultat d’une telle approche peut être influencé par des facteurs tels que le passage de cellule hôte et le nombre exact de bactéries ajoutées à infecter des hôtes, qui changent souvent entre expériences indépendantes. Une fonction supplémentaire unique de ce test est que les hydrogels ont une hauteur d’environ 40 µm, qui est suffisamment mince pour l’image à l’aide de la microscopie conventionnelle. Nous avons montré que nous pouvons effectuer avec succès tant microscopie des cellules vivantes et la fixation cellulaire et immunostaining suivie d’imagerie, sans introduire de fluorescence de fond élevé. Enfin, les hydrogels sont faites de deux couches, avec celle du haut ayant incorporé des microsphères fluorescentes, confinés dans un seul plan focal. Cet attribut fait en sorte qu’il n’y aura aucune lumière d’out-of-focus interférer en imagerie. La présence des perles permet les deux l’examen de la topographie de surface des gels pour s’assurer qu’ils sont uniformes et améliore les performances des TFM et MSM24,32,41. Avec TFM et MSM, il est possible de calculer les forces ECM-cellule et cellule-cellule respectivement des cellules résidant sur des matrices de rigidité. En utilisant ce nouveau dosage, il est possible de faire ces mesures de forces physiques en comparant les deux la contribution de rigidité environnementale et de l’infection en même temps. Suite à une telle approche, l’infection de l’effet a sur la cellule-hôte mécanique tout au long de son parcours peut être déterminée. En outre, l’évolution des contraintes intracellulaires des cellules peut être calculée à l’aide de MSM et peut être utilisée comme une mesure de l’intégrité de la barrière de la monocouche. Enfin, étant donné la nature multipuite du dosage, il est possible d’introduire en même temps des perturbations génétiques et pharmacologiques avec une infection bactérienne, d’étudier plus en profondeur les interactions complexes entre la mécanique de cellule hôte et l’infection.
Une limitation inhérente de la technique réside dans la rigidité de substrat effet pourrait avoir sur le taux de prolifération des cellules. En général, lors d’essais de l’infection, il faut veiller à ce que la densité cellulaire de l’hôte dans des conditions différentes est le même. C’est parce que la densité des cellules en soi peut avoir un effet sur la susceptibilité des hôtes à l’infection. Les cellules HMEC-1 qui ont été utilisées comme cellules de l’hôte ne présentent pas une différence significative de leur nombre, lorsque les graines pendant 24 h sur les hydrogels. Cependant, différents types de cellules peuvent présenter la prolifération différentielle, en fonction de la rigidité de l’hydrogel, qui peut biaiser les études d’infection. De même, partialité de l’infection peut survenir lorsque les cellules ne forment pas de monocouches ou n’attachent pas bien sur les hydrogels, comme cela se produit lorsque certains types de cellules sont ensemencées sur des matrices très douces (par exemple, les cellules endothéliales humaines du cordon ombilical ou Madin-Darby canine kidney cellules épithéliales boutonnée sur 0,6-kPa hydrogels54,55). Comme agents pathogènes sont concernés, certaines bactéries (p. ex., Borrelia burdgorferi) peuvent fixer sur cellules hôtes et envahir leur mais peut également transmigrer à travers eux56. Nous n’avons pas encore testé si ce dosage fonctionnerait pour les études de transmigration pathogène, mais il semble possible, étant donné que les études antérieures sur les neutrophiles transmigrant cellules endothéliales ensemencées sur hydrogels de PA ont été documentés pour travailler avec succès57. Il y a eu beaucoup d’études menées en montrant comment fabriquer des hydrogels de polyacrylamide d’une donnée d’Young en mélangeant les concentrations appropriées d’acrylamide et bis-acrylamide24,25,26 ,,27. Cependant, surtout lorsqu’on désire réaliser des expériences TFM sur cellules résidant sur hydrogels de raideur variable, il est essentiel de confirmer la rigidité attendue des hydrogels par AFM ou autres techniques de mise en retrait58. Légères déviations par rapport à la valeur attendue peuvent découler d’un autre solvant utilisé ou une solution mère d’acrylamide âgés, ou par les voies AFM, les mesures sont effectuées (par exemple, la forme de la pointe de l’AFM). Enfin, l’approche présentée dans la présente est issu des cellules hôtes sur matrices 2D, qui peuvent différer d’un scénario 3D plus réaliste et physiologiquement pertinent de l’ensemencement. Toutefois, fabrication gels 3D avec rigidité ajustable, les semis avec les cellules hôtes et puis les infecter par des agents pathogènes, toujours comprend certaines difficultés techniques. Néanmoins, nous prévoyons que dans un avenir proche, nous serons en mesure d’étendre le dosage en cours pour l’étude de l’infection dans un cadre 3D.
Pour résumer, le protocole décrit ainsi que les résultats préliminaires démontrent que ce nouveau dosage peut devenir un outil extrêmement utile pour l’étude de l’infection des cellules-hôtes adhérentes avec les bactéries pathogènes de façon quantitative et beaucoup plus physiologiquement pertinent environnement que précédemment examinés. La puissance de fabrication de polyacrylamide hydrogels dans la configuration proposée réside en ce que le dosage est compatible avec l’exécution de plusieurs techniques comme la cytométrie en flux, immunomarquage suivie par microscopie optique et microscopie à force traction. Le test peut être utilisé pour les études concernant l’infection de types cellulaires différents hôtes adhérentes par des agents pathogènes, que nous prévoyons aura un impact significatif dans les deux démêler les stratégies par lesquelles pathogènes infectent des hôtes et en facilitant le développement de interventions thérapeutiques contre les infections.
The authors have nothing to disclose.
Nos remerciements à M. pied de page, R. Lamason, M. Rengaranjan et les membres du laboratoire Theriot pour leurs discussions et la prise en charge expérimentale. Ce travail a été soutenu par les NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), la bourse de Gilliam HHMI pour Advanced Study (F.E.O.), le Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) et l’Association américaine de coeur (E.E.B.). Cytométrie en flux a été effectuée à l’installation de FACS partagé de Stanford.
Reagents | |||
Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate – 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
MES powder | Sigma | M3885 | |
KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
EGTA | Acros | 40991 | |
Disposable lab equipment | |||
12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
Razors | VWR | 55411-050 | |
Syringe needle | BD | 305167 | |
0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
20 ml syringes | BD | 302830 | |
0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
Vacuum chamber/degasser | Belart | 42025 | 37˚C and 5% CO2 |
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
Cage Incubator | Haison | Custom | |
Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
forceps | FST | 11000-12 | |
1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
Software | |||
Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
Matlab | Matlab Inc | ||
Flowjo | FlowJo, LLC | ||
Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |