We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.
Stijfheid van de extracellulaire matrix bestaat uit een van de meerdere milieu mechanische stimuli die zijn goed-gekend om te beïnvloeden cellulaire gedrag, functie en lot in het algemeen. Hoewel steeds meer aanhangend celtypes reacties op matrix stijfheid hebben gekenmerkt, hoe aanhanger cellen gevoeligheid voor bacteriële infectie is afhankelijk van stijfheid van de matrix is grotendeels onbekend, als is het effect van bacteriële infectie op de biomechanica van de cellen van de gastheer. We veronderstellen dat de gevoeligheid van de endotheliale cellen van de gastheer voor een bacteriële infectie is afhankelijk van de stijfheid van de matrix waarop deze cellen zich bevinden, en dat de infectie van de ontvangende met bacteriën cellen hun biomechanica veranderen zal. Om te testen deze twee hypothesen, werden endotheliale cellen gebruikt als model hosts en Listeria monocytogenes als een model ziekteverwekker. Door het ontwikkelen van een nieuwe multi goed formaat assay, laten we zien dat het effect van matrix stijfheid op infectie van endotheliale cellen door L. monocytogenes kwantitatief kan worden beoordeeld door middel van stroom cytometry en immunokleuring gevolgd door microscopie. Daarnaast kan gebruikt tractie kracht microscopie, het effect van L. monocytogenes infectie op host endothelial cel biomechanica worden bestudeerd. De voorgestelde methode geschikt is voor de analyse van het effect van weefsel-relevante mechanica op bacteriële infectie van Adherente cellen, die een essentiële stap naar het begrip van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix, en pathogene bacteriën. Deze methode geldt ook voor een grote verscheidenheid van andere types van studies inzake cel biomechanica en reactie op substraat stijfheid waar het is belangrijk om te kunnen vervullen vele replicatieonderzoeken parallel in elk experiment.
Cellen in de meest dierlijke weefsels zijn meestal aanhangend, zowel naar naburige cellen en hun extracellulaire matrix (ECM). De ankerplaats van cellen aan hun ECM is essentieel voor veel cellulaire processen, variërend van de beweeglijkheid van cel naar cel proliferatie en survival1,2. Cellulaire bevestigingspunt aan de ECM, is afhankelijk van zowel de samenstelling van de ECM en de stijfheid. Cellen reageren op veranderingen in de laatste door dynamisch herschikken hun cytoskelet, cel-cel en cel-ECM verklevingen, die op zijn beurt kritisch cel biomechanica en functies3,4,5,6 wijzigen . ECM stijfheid kan variëren in de ruimte (dat wil zeggen, anatomische locatie) tijdig (dat wil zeggen, veroudering), en in de pathofysiologische processen (b.v., arteriosclerose, kanker, infecties, enz.). Bijvoorbeeld, het is algemeen aanvaard dat endotheliale cellen op stijver-in vergelijking met zachtere-matrices uitoefenen van grotere krachten aan hun ECM en met elkaar en vertonen verhoogde beweeglijkheid en proliferatie7,8. Evenzo fibroblasten woonachtig op stijver matrices geven hoge contractiele krachten aan hun ECM en Toon meer proliferatie, beweeglijkheid en ECM productie9,10,11. Hoewel cel mechanica en reactie op ECM stijfheid zijn uitvoerig bestudeerd voor verschillende soorten cellen, de relatie tussen aanhangend gastheer cellen, is de stijfheid van hun ECM, en bacteriële infecties nog grotendeels onbekend.
De rol van ECM stijfheid in bacteriën-gastheer interacties van de cel studeren, werd L. monocytogenes (Lm) gekozen als het model pathogeen. LM is een alomtegenwoordige voedsel bacterie die leiden systemische infectie in een breed scala aan zoogdieren hosts tot kan. Deze facultatief intracellulaire pathogenen kunt verplaatsen van het intestinaal epitheel tot verre organen door het doorlopen van de verschillende soorten vasculaire endothelia. Als het schendt de bloed – hersen barrière, Lm meningitis kan veroorzaken, en wanneer deze de placenta kruist, het kan leiden tot spontane abortus12,13. LM kan infecteren andere host celtypes en kunt doen met behulp van verschillende pathogene strategieën. LM-infectie is meestal in het kader van epitheliale cellen, onderzocht, terwijl is veel minder bekend over hoe Lm kan infecteren en rondweg endotheliale cellen voering de lumen van bloedvaten14,15,16. Bovendien, het is nog grotendeels onbekend hoe de stijfheid van de ECM waar endotheliale cellen woont moduleert Lm de mogelijkheid om te vallen van deze cellen van de gastheer en vervolgens verspreiden. LM- en verschillende extra bacteriesoorten (d.w.z., Rickettsia parkeri) te profiteren van het actine cytoskelet van de ontvangende cellen ze beide besmetten binnenvallen in hun cytoplasma en vergemakkelijken van cel naar cel verspreiding17 , 18 , 19. zij bereiken dat door middel van de expressie van eiwitten waarmee ze interfereren met host actine polymerisatie trajecten en produceren van actine komeet staarten die hun voorwaartse voortstuwing16,20te vergemakkelijken. Als gevolg van infectie moet van de gastheercel actine cytoskelet dynamisch opnieuw rangschikken op een manier die nog niet volledig wordt gekenmerkt, potentieel beïnvloeden de biomechanica van de cellen van de gastheer met inbegrip van de fysieke krachten die zij op hun ECM en op elk uitoefenen andere. Om te onderzoeken van deze processen, menselijke microvasculaire endotheliale cellen (HMEC-1) werden gekozen als model gastheer cellen om drie redenen: 1. endotheliale cellen zitten bekend voor zitten zeer mechanosensitive als ze worden voortdurend blootgesteld aan variërende fysieke signalen21; 2. de strategieën die LM hanteert ter endotheliale cellen infecteren zijn nog grotendeels onbekend22; en 3. HMEC-1 kan een vereeuwigd cellijn zijn en daarom worden gemakkelijk gekweekt en onderworpen aan genetische manipulatie.
Bacteriële infectie van cellen van de gastheer is meestal studeerde in vitro door het zaaien van de cellen op glas of polystyreen substraten die aanzienlijk stijver dan de fysiologische ECM van de meeste cellen12,14,23. De infectie van cellen zaadjes op een matrix waarvan stijfheid fysiologisch relevante is bestuderen en toelichten van de rol van ECM stijfheid op de infectie van cellen door bacteriële pathogenen, we gevolgd een innovatieve aanpak gebaseerd op het fabriceren van dun microbead-embedded polyacrylamide hydrogels afstembare stijfheid op multi goed platen. De nieuwheid van de voorgestelde aanpak ligt in die zin dat het zorgt voor de opvolging van meerdere voorwaarden gelijktijdig als gevolg van de multi goed formaat en in dat deze compatibel is met meerdere technieken als gevolg van de bijzondere manier die de substraten zijn gebouwd. HMEC-1 cellen waren ontpit op deze eiwitten-bedekt hydrogels en dan besmet met verschillende Lm-stammen die TL op internalisering geworden zijn of constitutively tl. De rol van ECM stijfheid op infectie gevoeligheid van gastheer HMEC-1 cellen werd door stroom cytometry beoordeeld. Daarnaast immunokleuring en fluorescentie microscopie werden gebruikt om de daaraan vastzittende en verinnerlijkte bacteriën van elkaar onderscheiden. Ten slotte, tractie Force microscopie (TFM) werd met succes uitgevoerd karakteriseren van het effect van Lm infectie op de tractie benadrukt dat endotheliale cellen van de gastheer uitoefenen op hun matrices tijdens infectie. De voorgestelde bepaling kan eenvoudig worden aangepast zodat verdere studies over het effect van ECM stijfheid op infectie gevoeligheid van Adherente cellen met behulp van verschillende cellijnen of ziekteverwekkers.
Cellen kunnen een verscheidenheid van fysieke milieu signalen, waardoor niet alleen de cellen morfologie, maar ook hun gen expressie en eiwit activiteit, waardoor dus kritisch cel functies en gedrag45,46kunt voelen. De stijfheid van de ECM van cellen wordt steeds meer gewaardeerd als een belangrijke modulator van cellulaire motiliteit, differentiatie, proliferatie, en uiteindelijk cel lot47,48,49. Al zijn er vele recente vooruitgang in het begrip van de complexe biomechanische interactie tussen cellen en hun ECM, is weinig bekend over hoe milieu stijfheid is van invloed op de gevoeligheid van cellen voor bacteriële infectie. Ter vergemakkelijking van dergelijke studies, ontwikkelden we deze roman multi goed test gebaseerd op de reeds lang gevestigde fabricage van polyacrylamide hydrogels afstembare stijfheid die verenigbaar met de infectie testen50 is. Traditioneel, is een bacteriële infectie van cellen in de weefselkweek onderzocht op glas of polystyreen oppervlakken die ongeveer 1-3 ordes van grootte stijver dan de natuurlijke ECM van meest Adherente cellen8,51 zijn. De hier beschreven test opent nieuwe snelwegen doordat de studie van bacteriën-gastheer interacties in een fysiologisch relevante milieu stijfheid regime.
Voor het bewijs van concept van de voorgestelde bepaling, werden HMEC-1 cellen gekozen als model aanhangend gastheer cellen en Lm als een model bacteriële ziekteverwekker. De bepaling kan echter worden verlengd voor verdere studies, als op de juiste manier gewijzigd. Dergelijke studies kunnen betrekking hebben op besmetting van andere zoogdieren aanhangend host celtypes door extra ziekteverwekkers, zoals bacteriën en virussen. Voor deze bijzondere assay, gels zijn eiwitten-bedekt met collageen ik, maar het is afhankelijk van het celtype host, kunt u gebruik maken van het eiwit van een verschillende ECM-coating, zoals laminin of fibronectin, ter vergemakkelijking van de bijlage van de cellen van de gastheer van de rente over de hydrogel 52. een aanvullende vergoeding die afhankelijk van het celtype host is het bereik van de stijfheid hydrogel worden bestudeerd. Het bereik van stijfheid moet afhangen van wat is fysiologisch relevant voor de specifieke host celtype en hoe goed die host hecht een enkelgelaagde vormen op een bepaalde stijfheid hydrogel. Ook, afhankelijk van het model pathogen wensten te worden onderzocht, lichte wijzigingen mogelijk moet worden toegepast op de bepaling van de infectie die hierin worden beschreven.
De innovatie van de bepaling in vergelijking met de vorige methoden voor productie polyacrylamide hydrogels24,50,53 in bepaalde unieke functies ligt geïntegreerd in de bepaling van de voorgestelde infectie. Ten eerste zijn de hydrogels gebouwd op multi goed onder glasplaten, waarmee de screening van meerdere voorwaarden gelijktijdig evenals de automatisering van bepaalde procedures. Monitoring meerdere voorwaarden op hetzelfde moment of meerdere replicatieonderzoeken is van cruciaal belang omdat de uitkomst van een dergelijke aanpak kan worden beïnvloed door factoren zoals de ontvangende cel passage en het precieze aantal bacteriën toegevoegd aan het infecteren van de gastheren te onderzoeken, die vaak wijzigen tussen onafhankelijke experimenten. Een extra bijzonderheid van deze bepaling is dat de hydrogels een hoogte van ongeveer 40 µm hebben, die is dun genoeg om het imago met behulp van klassieke microscopie. We toonden dat we met succes uitvoeren kunnen levende cel microscopie en fixatie van de cel zowel immunokleuring gevolgd door imaging, zonder hoge achtergrond fluorescentie. Tot slot de hydrogels bestaan uit twee lagen, met de bovenste plaat fluorescerende microbeads, opgesloten in een enkele brandvlak hebben ingesloten. Dit kenmerk zorgt ervoor dat er geen out-of-focus licht mengen tijdens imaging. De aanwezigheid van de parels kan zowel het onderzoek naar de oppervlakte topografie van de gels om ervoor te zorgen dat ze zijn uniform en verbetert de prestaties van TFM en MSM24,32,41. Met TFM en MSM is het mogelijk om te berekenen van de cel-cel en cel-ECM krachten respectievelijk van cellen die zich op verschillende stijfheid matrices. Met deze nieuwe test, is het mogelijk te maken van dergelijke metingen van fysieke krachten door het vergelijken van beide de bijdrage van milieu stijfheid en infectie gelijktijdig. Na een dergelijke aanpak, de infectie effect heeft op de gastheercel mechanica in haar loop kan worden bepaald. Bovendien, de evolutie van de intracellulaire stress van cellen kan worden berekend met behulp van MSM en kan worden gebruikt als een maatregel van de integriteit van de barrière van de enkelgelaagde. Tot slot, gezien de multi goed aard van de test, is het mogelijk om gelijktijdig farmacologische en genetische verstoringen met een bacteriële infectie, te onderzoeken in meer diepte het complexe samenspel tussen gastheer cel mechanica en infectie.
Een inherente beperking van de techniek in de stijfheid van de substraat effect ligt zou kunnen hebben op het tempo van de proliferatie van de cellen. Meestal in infectie testen moeten ervoor zorgen dat de celdichtheid host onder verschillende omstandigheden hetzelfde. Dat komt omdat de celdichtheid zelf kan een effect hebben op de gevoeligheid van gastheren aan infectie. De HMEC-1-cellen die werden gebruikt als gastheer cellen weergeven een significant verschil in hun nummer wanneer geplaatste gedurende 24 uur op de hydrogels niet. Verschillende soorten cellen kunnen echter differentiële proliferatie, afhankelijk van de stijfheid van de hydrogel, die kan infectie studies bias vertonen. Ook kan bias van de infectie ontstaan wanneer cellen geen monolayers vormen of koppel niet goed op de hydrogels, zoals treedt op wanneer bepaalde soorten cellen worden overgeënt op zeer zacht matrices (b.v., menselijke navelstreng endotheliale cellen of Madin-Darby canine kidney epitheliale cellen zaadjes op 0.6-kPa hydrogels54,55). Wat ziekteverwekkers betreft, bepaalde bacteriën (bijvoorbeeld Borrelia burdgorferi) kunnen koppelen naar host cellen en vallen ze maar ook via hen kunt transmigrate56. We hebben nog niet getest als deze test voor pathogen transmigratie studies zou werken, maar het lijkt mogelijk aangezien vorige studies over transmigrating endotheliale cellen ontpit op PA hydrogels neutrofielen zijn gedocumenteerd te werken succesvol57. Er zijn veel studies verricht waaruit blijkt hoe voor de vervaardiging van polyacrylamide hydrogels van een bepaalde Youngs modulus door het mengen van de juiste concentraties van acrylamide en bis-acrylamide24,25,26 ,27. Vooral wanneer een verlangens TFM experimenten uitvoeren op cellen op hydrogels verschillende stijfheid, is het echter cruciaal voor het bevestigen van de verwachte stijfheid van de hydrogels via AFM of andere inspringing technieken58. Lichte afwijkingen van de verwachte waarde kunnen ontstaan als gevolg van een ander oplosmiddel gebruikt of een stamoplossing leeftijd acrylamide, of door de manieren AFM metingen zijn uitgevoerd (bijvoorbeeldde vorm van de AFM tip). Tot slot, de hierin gepresenteerde benadering is gebaseerd op het zaaien van de cellen van de gastheer op 2D matrices, die van een realistischer en fysiologisch relevante 3D scenario afwijken kunnen. Echter omvat productie 3D gels met afstembare stijfheid, zaaien ze met cellen van de gastheer en vervolgens besmetten ze met ziekteverwekkers, nog steeds bepaalde technische problemen. Wij verwachten evenwel dat wij in de nabije toekomst kunnen uitbreiden van de huidige bepaling zullen voor de studie van infectie in een 3D omgeving.
Kortom, het beschreven protocol samen met de voorlopige resultaten bewijzen dat deze nieuwe bepaling een uiterst nuttig hulpmiddel voor de studie van infectie van aanhangend gastheer cellen met pathogene bacteriën op een kwantitatieve manier en in een nog veel meer kan worden fysiologisch relevante milieu dan eerder onderzocht. De kracht van het fabriceren van polyacrylamide hydrogels in de voorgestelde setup ligt daarin de bepaling compatibel met de prestaties van meerdere technieken zoals stroom cytometry, immunokleuring is gevolgd door de lichte microscopie en tractie kracht microscopie. De bepaling kan worden gebruikt voor studies waarbij de infectie van andere aanhangend host celtypes door ziekteverwekkers, dat wij zal hebben een aanzienlijke invloed verwachten in zowel het ontrafelen van de strategieën waarbij pathogenen infecteren hosts en bij het bevorderen van de ontwikkeling van therapeutische interventies tegen infecties.
The authors have nothing to disclose.
Onze dank aan M. voettekst, R. Lamason, M. Rengaranjan en leden van de Theriot Lab voor hun discussies en experimentele ondersteuning. Dit werk werd gesteund door NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), de HHMI Gilliam Fellowship voor geavanceerde studie (F.E.O.), de Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) en de American Heart Association (E.E.B.). Stroom cytometry werd uitgevoerd op de Stanford gedeeld FACS faciliteit.
Reagents | |||
Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate – 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
MES powder | Sigma | M3885 | |
KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
EGTA | Acros | 40991 | |
Disposable lab equipment | |||
12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
Razors | VWR | 55411-050 | |
Syringe needle | BD | 305167 | |
0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
20 ml syringes | BD | 302830 | |
0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
Vacuum chamber/degasser | Belart | 42025 | 37˚C and 5% CO2 |
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
Cage Incubator | Haison | Custom | |
Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
forceps | FST | 11000-12 | |
1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
Software | |||
Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
Matlab | Matlab Inc | ||
Flowjo | FlowJo, LLC | ||
Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |