مقايسة المستندة إلى بولياكريلاميدي تنسيق متعدد جيدا لدراسة أثر صلابة المصفوفة خارج الخلية على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة
Summary
وقد وضعنا مقايسة المستندة إلى بولياكريلاميدي تنسيق متعدد جيدا لسبر تأثير صلابة المصفوفة خارج الخلية على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة. هذا التحليل متوافق مع التدفق الخلوي، وإيمونوستينينج، ومجهر القوة الجر، مما يسمح للقياسات الكمية للنشاط الحيوي تفاعلات بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية، والبكتيريا المسببة للأمراض.
Abstract
تصلب المصفوفة خارج الخلية تضم واحداً من المحفزات الميكانيكية البيئية متعددة معروفة جيدا للتأثير على السلوك الخلوية، ومهام، ومصير عموما. على الرغم من أن تتسم متزايدة أكثر من خلية ملتصقة أنواع الردود على صلابة مصفوفة، كيف تمسكا الخلايا التعرض للعدوى البكتيرية يعتمد على صلابة مصفوفة مجهولة إلى حد كبير، كما هو أثر العدوى البكتيرية على الميكانيكا الحيوية للخلايا المضيفة. نحن افترض أن قابلية خلايا المضيف بطانية لعدوى بكتيرية يعتمد على صلابة المصفوفة التي تتواجد هذه الخلايا، وأن انتقال العدوى إلى المضيف الخلايا مع البكتيريا ستتغير الميكانيكا الحيوية. لاختبار هذه الفرضيات اثنين، ممرض نموذجي خلايا بطانية كنموذج المضيفين و الليستريه المستوحدة . النامية تحليل رواية تنسيق متعدد جيدا، نظهر أن أثر صلابة مصفوفة على عدوى خلايا البطانية لام الليستريه يمكن تقييمها كمياً عن طريق التدفق الخلوي و immunostaining متبوعاً بالفحص المجهري. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مجهر القوة الجر، أثر العدوى الليستريه L. في الميكانيكا الحيوية غشائي خلية المضيف يمكن دراستها. تسمح الطريقة المقترحة لتحليل تأثير ميكانيكا النسيج ذات الصلة على العدوى البكتيرية من الخلايا ملتصقة، الذي يعد خطوة حاسمة نحو فهم التفاعلات النشاط الحيوي بين الخلايا، وهذه المصفوفة خارج الخلية، و البكتيريا المسببة للأمراض. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على مجموعة متنوعة من أنواع أخرى من الدراسات المتعلقة بالميكانيكا الحيوية في الخلية واستجابة لتصلّب الركيزة حيث من المهم أن تكون قادرة على أداء replicates عديدة في نفس الوقت في كل تجربة.
Introduction
الخلايا في الأنسجة الحيوانية الأكثر عادة ملتصقة، إرفاق كل من الخلايا المجاورة وهذه المصفوفة خارج الخلية (ECM). مرسى الخلايا لإدارة المحتوى في المؤسسة أمر بالغ الأهمية للعديد من العمليات الخلوية التي تتراوح من حركية خلية خلية الانتشار والبقاء على قيد الحياة1،2. مرسى الخلوية لإدارة المحتوى في المؤسسة يعتمد على كل من تكوين إدارة المحتوى في المؤسسة وصلابة. الخلايا التي تستجيب للتغيرات في هذا الأخير بإعادة ترتيب بشكل حيوي على سيتوسكيليتون، والالتصاقات ECM خلية وخلية خلية، مما يغير بدوره حاسمة خلية الميكانيكا الحيوية ووظائف3،،من45،6 . يمكن أن تختلف صلابة ECM في الفضاء (أيموقع التشريحية)، في الوقت المناسب (أي، الشيخوخة)، وفي العمليات الفيزيولوجية المرضية (مثلاً، وتصلب الشرايين، والسرطان، والعدوى، إلخ). على سبيل المثال، من المقبول على نطاق واسع أن غشائي الخلايا الموجودة على تشديد-بالمقارنة مع ليونة مصفوفات بذل زيادة القوات إدارة المحتوى في المؤسسة وبعضها البعض ويحمل زيادة حركية وانتشار7،من8. وبالمثل، الليفية المقيمين في مصفوفات أغلظ نقل قوات الهوس عالية لإدارة المحتوى في المؤسسة على وإظهار زيادة انتشار وحركية، وإدارة المحتوى في المؤسسة إنتاج9،،من1011. على الرغم من أن ميكانيكا الخلية واستجابة لتصلّب إدارة المحتوى في المؤسسة وقد درست على نطاق واسع لمختلف أنواع الخلايا، العلاقة بين الخلايا المضيفة ملتصقة، تصلب إدارة المحتوى في المؤسسة، والعدوى البكتيرية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.
لدراسة دور صلابة ECM في تفاعلات الخلية البكتيريا المضيفة، اختير لام الليستريه (Lm) الممرض النموذجي. لم هو بكتيريا تنقلها الأغذية في كل مكان يمكن أن تسبب العدوى المجموعية في مجموعة متنوعة واسعة من المضيفين الثدييات. يمكن نقل هذا الممرض داخل الخلايا اختياري من ظهارة الأمعاء إلى الأجهزة البعيدة بمروره بأنواع مختلفة من الجهاز الوعائي. إذا أنها تخرق حاجز الدم في الدماغ، لم يمكن أن يسبب التهاب السحايا، وعندما يعبر المشيمة، فإنه يمكن أن يسبب الإجهاض العفوي12،13. يمكن أن تصيب مضيف مختلف أنواع الخلايا Lm ويمكن القيام بذلك باستخدام استراتيجيات متميزة المسببة للأمراض. ودرست العدوى Lm معظمها في سياق الخلايا الظهارية، بينما يعرف أقل بكثير عن كيف يمكن أن تصيب Lm وتجاوز خلايا بطانية بطانة التجويف الأوعية الدموية14،،من1516. وعلاوة على ذلك، أنها لا تزال غير معروفة إلى حد كبير كيف ينظم صلابة لإدارة المحتوى في المؤسسة التي يقيم فيها خلايا بطانية Lm للقدرة على غزو هذه الخلايا المضيفة وانتشرت بعد ذلك. Lm وعدة أنواع بكتيرية إضافية (أي، باركيري الريكتسية) الاستفادة من cytoskeleton أكتين المضيفة غزو في السيتوبلازم الخلايا أنها تصيب على حد سواء وتيسير نشر خلية إلى17 , 18 , 19. أنها تحقيق ذلك من خلال التعبير عن البروتينات التي تمكنهم من التدخل في مسارات بلمرة الأكتين المضيف وإنتاج أكتين ذيول المذنبات التي تيسر على الدفع إلى الأمام16،20. نتيجة للإصابة، أكتين سيتوسكيليتون للخلية المضيفة يحتاج إلى إعادة ترتيبها بشكل حيوي بطريقة لا تزال غير كاملة تتسم، يحتمل أن تؤثر على الميكانيكا الحيوية الخلايا المضيفة بما في ذلك القوات المادية التي يبذلونها إدارة المحتوى في المؤسسة وعلى كل الأخرى. لدراسة هذه العمليات، اختيرت البشرية خلايا بطانية microvascular (هميك-1) نموذج الخلايا المضيفة لثلاثة أسباب: 1-تعرف خلايا بطانية لتكون الغاية ميتشانوسينسيتيفي كما أنهم يتعرضون باستمرار لاختلاف21من الرموز المادية؛ 2-استراتيجيات Lm توظف لتصيب خلايا بطانية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير22؛ و 3. هميك-1 هي خط خلية مخلدة ويمكن، لذلك، بسهولة مثقف وتعرض للتلاعب بالجينات.
وقد العدوى البكتيرية من الخلايا المضيفة معظمهم درس في المختبر بزرع الخلايا على الزجاج أو البوليستيرين الركازات التي أشد كثيرا مما ECM الفسيولوجية لمعظم الخلايا12،،من1423. دراسة عدوى الخلايا المصنفة في مصفوفة التي تصلب من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة، وتوضيح دور صلابة ECM على عدوى الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية، اتبعنا نهج مبتكر يستند إلى اختﻻق رقيقة الهلاميات المائية جزءا لا يتجزأ من ميكروبيد polyacrylamide من تيبس الانضباطي في لوحات متعددة جيدا. تكمن جدة النهج المقترح يسمح رصد ظروف متعددة في وقت واحد بسبب شكلها متعددة جيدا، وفي هذا ومتوافق مع تقنيات متعددة بسبب طريقة خاصة مبنية ركائز. هميك-1 الخلايا المصنفة في هذه الهلاميات المائية المغلفة بالبروتين وثم المصابين بسلالات مختلفة لم تصبح الفلورسنت عند تدخيل أو أنها مؤثرا الفلورسنت. وتم تقييم دور صلابة ECM على قابلية الإصابة بالخلايا المضيفة هميك-1 بالتدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت الفحص المجهري إيمونوستينينج والأسفار للتفريق بين البكتيريا المنضمة والمدخلة. أخيرا، أجرى الفحص المجهري قوة الجر (ينص) بنجاح لتميز أثر العدوى Lm في الجر وتشدد على أن تمارس خلايا المضيف بطانية على تلك المصفوفات أثناء الإصابة. يمكن بسهولة تعديل المقايسة المقدمة لتمكين مزيد من دراسات بشأن تأثير صلابة ECM على قابلية العدوى من الخلايا ملتصقة باستخدام خطوط مختلفة الخلية أو مسببات الأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
بمعنى خلايا العديد من الإشارات البيئية المادية، التي يمكن أن تؤثر على مورفولوجيا الخلايا ليس فقط، بل أيضا على الجينات النشاط التعبير والبروتين، مما يؤثر على الخلية الحيوية وظائف والسلوكيات45،46. ويقدر متزايد صلابة لإدارة المحتوى في المؤسسة الخلايا المغير هامة حركية الخلوية والتمايز، والانتشار، وفي نهاية المطاف خلية مصير47،،من4849. على الرغم من أن هناك العديد من أوجه التقدم الأخيرة في فهم التفاعل المعقد بين الخلايا وإدارة المحتوى في المؤسسة على النشاط الحيوي، يعرف الكثير عن تصلب البيئة كيف يؤثر على قابلية الخلايا للعدوى البكتيرية. لتسهيل مثل هذه الدراسات، قمنا بتطوير هذا الفحص جيدا متعددة رواية استناداً إلى تلفيق راسخة من الهلاميات المائية polyacrylamide من صلابة الانضباطي الذي يتوافق مع فحوصات العدوى50. تقليديا، درست عدوى بكتيرية من الخلايا في نسيج الثقافة على الزجاج أو البوليستيرين السطوح التي حوالي 1-3 أوامر من حجم أقسى من المحتوى الطبيعي من8،الخلايا الأكثر ملتصقة51. والرزن الموصوفة هنا فتح الطرق الجديدة بتمكين دراسة التفاعلات البكتيريا المضيفة في نظام تصلب بيئية ذات صلة فسيولوجيا.
لإثبات المفهوم للمقايسة المقدمة، تم اختيار الخلايا هميك-1 كنموذج الخلايا المضيفة ملتصقة و Lm ممرض جرثومي نموذج. ومع ذلك، يمكن تمديد المقايسة لإجراء المزيد من الدراسات إذا كان تعديل مناسب. يمكن أن تشمل هذه الدراسات الإصابة بأنواع مختلفة من الثدييات المضيفة ملتصقة الخلية بمسببات إضافية، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات. لهذا التحليل خاصة، المواد الهلامية كانت البروتينات المغلفة مع الكولاجين أنا، ولكن تبعاً لنوع الخلية المضيفة، من الممكن استخدام بروتين ECM مختلفة-طلاء، مثل laminin أو فيبرونيكتين، تيسيرا للمرفق للخلايا المضيفة للفائدة على المائية 52-وهناك اعتبار آخر يعتمد على نوع الخلية المضيفة هو مدى صلابة المائية ينبغي أن تدرس. ينبغي أن يتوقف مدى صلابة على ما هو ذات الصلة الفيزيولوجية لنوع الخلية المضيفة محددة ومدى تعلق التي تستضيف تشكيل أحادي الطبقة في هيدروجيل صلابة معطى. وبالمثل، اعتماداً على الممرض النموذج المطلوب لفحصها، قد تحتاج تعديلات طفيفة سيتم تنفيذها على فحص الإصابة المبينة في هذا التقرير.
ابتكار التحليل مقارنة بالطرق السابقة للتصنيع polyacrylamide الهلاميات المائية24،،من5053 يكمن في بعض ميزات فريدة من نوعها إدماج التحليل المقترح العدوى. أولاً، الهلاميات المائية مبنية على لوحات أسفل الزجاج جيدا المتعددة، الذي يتيح فحص شروط متعددة في وقت واحد، فضلا عن أتمتة إجراءات معينة. رصد ظروف متعددة في نفس الوقت أو دراسة replicates متعددة أمر حاسم نظراً لنتائج مثل هذا النهج يمكن أن يتأثر بعوامل مثل مرور الخلية المضيفة والعدد الدقيق للبكتيريا المضافة لتصيب الأجهزة المضيفة، التي غالباً ما تتغير بين التجارب المستقلة. ميزة إضافية فريدة من نوعها لهذا التحليل أن الهلاميات المائية ارتفاع حوالي 40 ميكرومتر، ورقيقة ما يكفي الصورة باستخدام الفحص المجهري التقليدي. لقد أظهرنا أننا يمكن بنجاح تنفيذ خلية حية مجهرية وتثبيت الخلية، وإيمونوستينينج تليها التصوير، دون الأخذ بالأسفار خلفية عالية. وأخيراً، الهلاميات المائية مصنوعة من طبقتين، مع واحد العلوي بعد المضمنة ميكروبيدس نيون، تقتصر المستوى البؤري واحد. هذه السمة يضمن أنه لن يكون هناك أي ضوء خارج نطاق التركيز التدخل أثناء التصوير. ويتيح وجود الخرز كل دراسة التضاريس السطحية للمواد الهلامية لضمان أن تكون موحدة ويحسن أداء ينص، والرجال الذين يمارسون اللواط24،،من3241. ينص والرجال الذين يمارسون اللواط، من الممكن لحساب قوي ECM خلية وخلية-خلية على التوالي من الخلايا المقيمة على اختلاف مصفوفات صلابة. باستخدام هذا الفحص الرواية، من الممكن جعل هذه القياسات للقوى المادية بمقارنة كل مساهمة من صلابة البيئية والإصابة في وقت واحد. في أعقاب مثل هذا نهج، على أثر العدوى الخلية المضيفة يمكن تحديد ميكانيكا طوال مساره. بالإضافة إلى ذلك، تطور الضغوط داخل الخلية من الخلايا يمكن حسابها باستخدام الرجال الذين يمارسون اللواط ويمكن استخدامها كمقياس لسلامة الحاجز أحادي الطبقة. وأخيراً، نظراً لطبيعة متعددة جيدا التحليل، من الممكن ﻹدخال الاضطرابات الوراثية والدوائية مع عدوى بكتيرية، التحقيق بمزيد من التعمق في التفاعل المعقد بين الميكانيكا الخلية المضيفة والإصابة في وقت واحد.
قد يكون أحد الملازمة للحد من هذه التقنية تكمن في صلابة الركازة تأثير على معدل انتشار الخلايا. عادة، في فحوصات العدوى، نحن بحاجة إلى ضمان أن كثافة الخلايا المضيفة تحت ظروف مختلفة هو نفسه. وهذا نظراً لكثافة الخلية بحد ذاته يمكن أن يكون لها تأثير على قابلية المضيفين للإصابة. عدم إظهار الخلايا هميك-1 التي استخدمت كالخلايا المضيفة اختلافاً كبيرا في عددها عند المصنف ح 24 على الهلاميات المائية. ومع ذلك، أنواع مختلفة من الخلايا قد يحمل الانتشار التفاضلي، اعتماداً على صلابة المائية، التي يمكن أن التحيز دراسات عدوى. وبالمثل، يمكن أن تنشأ التحيز العدوى عند الخلايا لا تشكل مونولاييرس أو لا تقم بإرفاق جيدا في الهلاميات المائية، كما يحدث عند بعض أنواع الخلايا هي تبذر في مصفوفات لينة جداً (مثلاً، والخلايا البطانية البشرية الحبل السري أو مدين-داربي الكلاب الكلي الخلايا الظهارية المصنف على 0.6-الجيش الشعبي الكوري الهلاميات المائية54،55.) وبقدر ما يتعلق بمسببات الأمراض، يمكن إرفاق بعض البكتيريا (مثلاً، بوردجورفيري البورليه) على استضافة الخلايا وغزو لهم ولكن يمكن أيضا ترانسميجراتي من خلالهم56. ونحن لم بعد اختبارها إذا سيعمل هذا التحليل لدراسات الهجرة الممرض، ولكن يبدو من الممكن منذ تم توثيق الدراسات السابقة على العَدلات ترانسميجراتينج غشائي الخلايا المصنفة في الهلاميات المائية السلطة الفلسطينية أن تعمل بنجاح من57. وهناك الكثير من الدراسات التي أجريت تبين كيفية صنع الهلاميات المائية polyacrylamide لمعامل معين للشباب عن طريق خلط التركيزات المناسبة من الاكريلاميد ومكررا-مادة اكريلاميد24،25،26 ،27. ومع ذلك، خاصة عند أحد يرغب في القيام بتجارب ينص على الخلايا المقيمين في الهلاميات المائية صلابة متفاوتة، المهم لتأكيد صلابة المتوقعة من الهلاميات المائية عن طريق فؤاد أو سائر تقنيات المسافة البادئة58. انحرافات طفيفة من القيمة المتوقعة يمكن أن تنشأ بسبب مختلف المذيبات المستخدمة أو حلاً أسهم اكريلاميد الذين تتراوح أعمارهم بين، أو بطرق فؤاد القياسات المنجزة (مثلاً، شكل تلميح فؤاد). وأخيراً، يستند النهج المقدمة في هذه الوثيقة البذر الخلايا المضيفة في مصفوفات ثنائية الأبعاد، التي يمكن أن تختلف عن سيناريو ثلاثي الأبعاد أكثر واقعية وفسيولوجيا ذات الصلة. بيد تصنيع المواد الهلامية 3D مع تصلب الانضباطي، بذر منهم مع الخلايا المضيفة وثم يصيب لهم مع مسببات الأمراض، لا يزال يشمل بعض الصعوبات التقنية. ومع ذلك، نحن نتوقع أن في المستقبل القريب ونحن سوف تكون قادرة على توسيع نطاق التحليل الحالي لدراسة الإصابة في أجواء ثلاثية الأبعاد.
خلاصة القول، البروتوكول وصف جنبا إلى جنب مع النتائج الأولية تقديم أدلة على أن هذا التحليل رواية يمكن أن تصبح أداة مفيدة للغاية لدراسة الإصابة بالخلايا المضيفة ملتصقة بالبكتيريا المسببة للمرض بطريقة كمية، وفي كثير ذات الصلة فسيولوجيا البيئة مما سبق فحصها. السلطة من اختﻻق polyacrylamide الهلاميات المائية في إعداد المقترح يكمن في ذلك المقايسة متوافق مع أداء تقنيات متعددة مثل التدفق الخلوي، إيمونوستينينج متبوعاً بالفحص المجهري الخفيفة وقوة الجر مجهرية. التحليل يمكن أن يستخدمها للدراسات المتعلقة بعدوى أنواع الخلايا المضيفة ملتصقة مختلف مسببات الأمراض، التي نتوقع سيكون لها أثر كبير في كشف كل الاستراتيجيات التي تصيب الكائنات الممرضة المضيفين وتيسير تطوير التدخلات العلاجية ضد الالتهابات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نتقدم بالشكر إلى م. تذييل، R. لاماسون، م. رينجارانجان، وأعضاء مختبر ثيريوت لمناقشاتهم ودعم تجريبية. وأيد هذا العمل R01AI036929 المعاهد الوطنية للصحة (J.A.T.)، HHMI (J.A.T.)، وزمالة غيليام HHMI للدراسة المتقدمة (F.E.O.)، وزمالة خريج جامعة ستانفورد (F.E.O.)، وجمعية القلب الأمريكية (E.E.B.). وأجرى التدفق الخلوي في “مرفق نظام مراقبة الأصول الميدانية المشتركة في جامعة ستانفورد”.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
| 25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
| 40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
| Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
| Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
| TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
| Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
| Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
| HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
| Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
| MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
| Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
| Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
| DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
| Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
| Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
| DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
| BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate – 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
| Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
| 0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
| COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
| Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
| Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
| MES powder | Sigma | M3885 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
| MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
| EGTA | Acros | 40991 | |
| Disposable lab equipment | |||
| 12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
| 5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| 15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
| Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
| Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
| Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
| Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
| Razors | VWR | 55411-050 | |
| Syringe needle | BD | 305167 | |
| 0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| 20 ml syringes | BD | 302830 | |
| 0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
| Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
| Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
| Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
| Vacuum chamber/degasser | Belart | 42025 | 37˚C and 5% CO2 |
| Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
| Cage Incubator | Haison | Custom | |
| Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
| Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
| Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
| pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
| forceps | FST | 11000-12 | |
| 1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
| Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
| Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
| Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
| Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
| Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
| Software | |||
| Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
| Matlab | Matlab Inc | ||
| Flowjo | FlowJo, LLC | ||
| Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
- Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
- Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
- Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
- LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
- Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A., Bhatia, S. K. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. , 19-37 (2012).
- El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, 146-151 (2017).
- Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
- Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
- Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, (2014).
- Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
- Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
- Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
- Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
- Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
- Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
- Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
- Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
- Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
- del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
- Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
- Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
- Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
- Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
- Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
- Wu, T. -. C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
- Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
- Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
- Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
- Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
- Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
- Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
- Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
- Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
- Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -. S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
- Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
- Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
- Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
- Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
- Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).
