強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

1. RNP アセンブリ 早めに前もってすべての蛋白質、DNA、RNA コンポーネントの取得実験をデザインします。最初のパスとして表 1 肯定的なコントロールの 1 つし、信頼性の高い実験的なデザインと材料の整合性を確保する材料の表に記載されている市販試薬を使用します。新しいゲノム編集実験計画に関する追加ヒントについては、このトピック12,42,43にペーパーを参照してください。注: 以降の手順で説明するように組み立てられる、結合の事前準備で保存されるかもしれない-80 ° C ターゲット遺伝子を選択すると、1 つの無料のオンライン ツールを使用して、デザイン、最適な gRNA44,45,の46,47,48。ノックアウトを生成したい場合はエクソンをターゲットしてください。注: これらのツールは隣接するs. 化膿PAM とターゲット サイトを識別するために役立つシーケンス、高品質スコア、およびオフのターゲット スコアが低い。 公開メソッド8までのs. 化膿Cas9 蛋白質を浄化や商用ベンダーから購入。 RNA の希釈、RNP の準備、KCl、10% グリセロールと TCEP の 1 mM HEPES pH 7.5、150 mM の 20 mM を含むタンパク質ストレージに典型的な Cas9 バッファーを準備します。常に再懸濁しますや劣化を防ぐために RNA を希釈に使用されるバッファーのヌクレアーゼ フリー水を使用します。 公開されたメソッドを使用して生体外のトランスクリプションによるガイド RNA (tracrRNA、crRNA または sgRNA) を作ったり、核酸合成会社17,21,49,から購入50,51。 遺伝子を挿入するには場合、は、合成またはドナーの DNA のテンプレートを購入します。 タンパク質と RNA 因数-80 ° C で融解を使用の直前に氷の上に格納します。注: 各凍結融解は若干効率を低下させます。Cas9 精製52と sgRNAs53の生体外のトランスクリプションのための詳細は、オープン アクセス プロトコルが別の場所であります。 C. の elegansを操作する場合は、手順 1.5 に進みます。P. hawaiensisプロトコル 1.6 のステップに進みます。SgRNA を使用している場合は、1.4 の手順に進みます。1.3 一次電池を編集するための gRNA を組み立てるためのステップへ進みます。 TracrRNA と crRNA の等モル量を混合することによって、gRNA を組み立てます。約 50 のゲノム編集実験のための 80 μ M gRNA 株式の 100 μ L を作る。 30 分の 37 ° C で gRNA をインキュベートし、ゆっくりと部屋の温度に冷却します。 HSPC と T セルの編集の RNP 準備: 約 30 gRNA (Cas9 バッファーで希釈済み) に集中 Cas9 を追加非常にゆっくりと、10 μ L の総ボリュームの Cas9 蛋白質の 200 pmol に gRNA の 1-2 x のモル量を混合することによって、RNP 複合を組み立てる s、ピペット、20 μ M の最終 Cas9 濃度をもたらす迅速な円を作るします。 エレクトロポレーション キュベットを準備します。注: このプロトコルは、材料表に掲げる商業システムに固有、RNP 編集他のエレクトロポレーションのデバイスと達成することができます。 各キュベットに 5 μ L (100 pmols, T 細胞) または RNP の 10 μ L (200 pmol、HSPCs) を追加します。 かどうか、ノックアウトを作るのではなく、新しい DNA を挿入するキュベットやプレートのウェルに 100 μ M (100 pmol) 一本鎖オリゴヌクレオチド ドナー DNA (ssODN)25,,5455の 1 μ L を追加。 一次電池の編集では、次の手順の手順 2 にスキッププロトコル。 RNP線虫を編集するための準備: 20 μ L (最終濃度は、括弧内に記載されています) の最終的なボリュームを作成するために以下の試薬を追加して複雑な要件を組み立てる: Cas9 (2 μ M)、HEPES pH 7.5 (10 μ M)、KCl (115 μ M)、crRNA (12 μ M)、tracrRNA (40 μ M) と、修理のテンプレートに必要な場合(0.5 μ M ssDNA または 350 ng/μ L dsDNA まで)。注: Cas9 を介した DSB テンプレート修理の効率は dsDNA 修理構成体の濃度に比例したがってより効率的な修理テンプレート濃度が高いテンプレートの修理。ただし、dsDNA の 350 ng/μ L 以上を含む混合物の注入は、注入されたワームの可能性を減らすために示されています。したがって、その致死率を最小限に抑えながら修理効率を最大化するためにミックスに dsDNA の 350 以上 ng/μ L がするように、使用することをお勧めします。 複数の遺伝子を同時にターゲット、説明する co CRISPR/共同 conversion スクリーニング アプローチに必要な手順で 5.4 に複数の crRNAs を追加します。1 つ以上の crRNA を追加すると、それぞれ順番にマスター ミックスを追加します。注: 各 crRNA の量は、同じである必要はありません、特定の位置の突然変異の頻度を妨害するも Cas9 の濃度を変更することがなくマスター ミックスで crRNAs の濃度を 2 倍が表示されません。例をペらでくわしく説明します。56。 ピペッティングで混ぜるし、5 の 16,000 x g で RNP ソリューションをスピン s 管の底でソリューションを収集できることを確認します。 15 m の 37 ° C でソリューションを孵化させなさい。 薄い退屈マイクロインジェクション針を詰まらせる可能性があります任意の粒子をペレットに 1 分 16,000 x g でサンプルを遠心します。以降の手順で上清を使用します。 線虫のプロトコルの残りの部分に対して、手順 4 に進みます。 P. hawaiensis編集の RNP 準備: ヌクレアーゼ フリー水と (注射を可視化) 用フェノールレッド Cas9 と 0.15% フェノールレッドの 6.25 μ M の最終濃度に希釈することで使い捨て Cas9 因数を準備します。 6 μ l。 追加 12 pmol Cas9 の gRNA、2 μ M、4-8 μ M の gRNA 濃度 0.05% のフェノールレッド濃度最終 Cas9 濃度をもたらすための総量 Cas9 タンパク質 gRNA の x 2-5 を混合することによって複雑な RNP を組み立てます。 RNP の複雑に 10 分間、室温で混合物を孵化させなさい。 P. hawaiensisの編集では、次の手順の手順 6 にスキッププロトコル。 2. 細胞培養そして準備は 注: 生物学的安全キャビネットで 2.1.1 に 3.3.3 の手順に従います。 購入凍結人間動員末梢血 CD34+ HSPCs ベンダーから。 〜 1 を解凍 x106 HSPCs 37 ° C の水で 3 分のバス ・ 15 mL の円錐管にそれらを転送します。商業ソースから拡張の無血清培地 10 mL を追加し、10 分、上清を除去し、補われた論文の 2 mL の細胞を再懸濁します 100 x g で混合物をスピンします。6 ウェル プレートで細胞をプレートし、RNP エレクトロポレーション前 24-48 h の 37 ° C の定温器でそれらを文化します。 診断とセルをカウントし、必要な HSPCs (electroporated にキュベットあたり 150,000-200,000 HSPCs) の合計数を遠心管に転送します。 細胞のペレットを 10 分間 100 x g でチューブをスピンします。 人間プライマリ CD4 を購入仕入先から+ T 細胞密度勾配遠心法29ひと全血から分離するか。 T 細胞の活性化の前にあらかじめコート αCD3 48 ウェル文化板 (UCHT1) と αCD28 (CD28.2)。500 μ L の 10 μ G/ml αCD3、37 ° C で少なくとも 2 時間 PBS で 10 μ G/ml αCD28 でプレートをコートします。注: いくつかの遺伝子座の NHEJ ことがなく実現されます前の刺激が、その効率を最大限にこのステップを含みます。 ΑCD3/αCD28 抗体結合プレート [RPMI 1640 を添加した 5 mM HEPES の 2 L-グルタミン、商業代わりのペニシリン/ストレプトマイシン、2-メルカプトエタノール、5 mM の 50 μ M の 50 μ g/mL RPMI 完全培地で 37 ° C で 48 時間培養 T 細胞非本質的なアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムの 10% (巻/巻) FBS 5 mM]。500 μ L のメディア/48 ウェル プレートのウェルに 2,000,000 の T 細胞の密度で培養 T 細胞。 検定と転送を使用してセルを数える T、エレクトロポレーションに必要な T 細胞の総数は、遠心管に (electroporated にキュベットあたり 100,000-1,000,000 T 細胞) を試してみてください。 細胞のペレットを 8 分間 90 x g でチューブをスピンします。セルは、密度勾配分離 2 日以内をされている場合は、8 分の 200 x g でスピンします。 両方の細胞の種類の任意の気泡を除去ピペット/真空上清を吸引します。 優しくキュベットあたりエレクトロポレーション バッファーの 20 μ L で細胞を再懸濁します。 すでに泡を作成せず、上下ピペッティングでよく RNP とミックスの 10 μ L を含む各のキュベットに (150,000-200,000 HSPCs または 100,000-1,000,000 T 細胞) の細胞の 20 μ L を追加します。 3. RNP エレクトロポレーション Electroporate、nucleofector でそれらを配置した後キュヴェット。HSPCs、パルス コード ER100 を使用します。T 細胞のパルス ・ コード EH 115 を使用します。 HSPCs のみ:補完論文媒体 (37 ° C に加温) エレクトロポレーションと 10 ~ 15 分のセルを回復した直後にそれぞれキュベットに追加 100 μ l 文化 96 ウェル丸底のプレートし、24 h の補完論文中の追加の 100 μ L を追加するセルを転送します。 新鮮な補完論文中にそれらを変更、さらに 24-72 時間インキュベートします。 遺伝子型の細胞を除去して 48 96 h のポスト-エレクトロポレーション。5 分間 300 x g でセルをスピンし、DNA の抽出 (8.2 の手順) を開始する前に、上清を除去します。 T 細胞のみ: RPMI 80 μ 完了文化メディア マルチ チャンネル ピペットを使用して (必要に応じて) 各キュベットまたは井戸、貯水池からの 37 ° C に加温を追加。 37 ° C 15 分でそれらを孵化させなさい。 先プレートに適切なメディア、抗体、サイトカイン等を追加し、37 ° C の定温器で暖める前。 マルチ チャンネル ピペットを使用して (必要に応じて) 丸底 96 ウェル プレートに井戸から 107 μ electroporated セルを転送します。 編集の成果を評価する方法については、手順 8 に進みます。 4. c. の elegansの準備 マイクロインジェクションの前日: マイクロインジェクションの agarose のパッドを準備します。 水にアガロースを追加し、ホット プレートや電子レンジで沸騰させるソリューションをもたらす水の 3% (w/v) アガロース溶液を作る。 24 mm × 50 mm × 1.5 mm カバー ガラス スライド テーブルを手配し、ガラス パスツール ピペットを使用してスライドにアガロース溶液の小さな (~ 15 μ L) のドロップを配置します。すぐに agarose ドロップ別 coverslip の上に配置することで平らにします。アガロースを固めるし、coverslips のいずれかを削除するを許可します。 卓上乾燥して一晩 agarose コーティング coverslip の顔アップを残します。24 時間後に、清潔で乾燥した容器に agarose パッドを格納します。注: これらは無期限に使用することができます。 マイクロインジェクション針を引く: フィラメントとホウケイ酸塩のガラス管を使用して (外径 1.0 mm、内側直径 0.58 mm)、メロ、火災57と58その他のリソースに基づいて針を引きます。針はすぐに使用することができます。 または粘土サポートによるブレース、清潔で乾燥した容器で保存することができます。 ワームのメンテナンス、ペトリ板に注ぎ、OP50 細菌の斑点のあるマツ材線虫病成長メディア (NGM) 寒天培地を準備 (プロトコルが標準的なc. の elegansメンテナンスと成長媒体のためのレシピは、Stiernagle59を参照してください)。 マイクロインジェクションのワームをステージ: マイクロインジェクション、前に 12-24 時間 OP50 細菌の新しい NG 寒天プレートに L4 段の両性具有をピックアップし、20 ° C でそれらを一晩インキュベート各 Cas9 ターゲット/注入ミックス プレート 〜 30 ワームを選ぶ。 マイクロインジェクションの日:1.5 準備した上澄み RNP ソリューションで引っ張られたマイクロインジェクション針をロードします。 (一般的に読み込み未満 0.1 μ L) 準備マイクロインジェクション針にキャピラリー ピペットから引っ張られた毛細管ピペットとバックフィル ソリューションへのステップ 1.5.4 から上澄みをピペットします。 マイクロマニピュレーターに接続されているマイクロインジェクション装置に読み込まれた針をマウントします。250 kPa と 25 kpa バランス圧力噴射装置の圧力を設定します。 鋭い針のエッジを生成する読み込まれた針先をブレーク バック。15 mm x 15 mm x 24 mm x 50 mm x 1.5 mm coverslip の上部に 1.5 mm の正方形 coverslip の場所。 ハロカーボン オイル 700 平方 coverslip の一方の端をオーバーレイします。 15 mm の正方形のカバーガラスの端、油に針を置きます。 顕微鏡ステージと coverslip ガイド、注入ペダル/ボタンを押したまま、針の端に沿ってスライドをブラシに手を使用してください。針先、針から液体の流れを増やすを破る。〜 1 バブル/s を形成、針の端に沿って流れを混ぜて注射することによって最適な流量を実現します。 マイクロインジェクションの前に 12-24 時間を選んだ L4 ワーム注入の日に発達段階の若い大人であることを確認します。OP50 細菌を欠いている NG 寒天プレートに若い大人のワームを選ぶし、5 分、周りをクロールできるようにします。これは針下駄を最小限に抑え、注入のパッドに転送される細菌の量を減らします。 郭清範囲に agarose インジェクション パッド/coverslip を配置します。ワームのピックを使用してパッドの 1 つの端に沿ってハロカーボン オイルの小さいトラックを置きます。 NG 寒天プレートとオイルのトラックにいくつかのワームを持ち上げて油でコーティング ワーム pick を使用する。細い髪、まつげや猫のひげなどのピペットに添付の平行、優しく agarose パッドにワームをプッシュにワームを配置します。までマイクロインジェクション手順に慣れて、マウントのみ、一度に 1 つのワームを注入します。注: 乾燥アガロースはワーム、パッドに付着させてから水分を芯します。ワームを脱水することができます、したがって、1 つはすぐに働かなければなりません。 一度の位置およびハロカーボン オイル (~ 20 μ L) ワームの先端から数滴を選ぶ別のワームをオーバーレイ パッドに接続されています。 5 します結合と投与後気にc. の elegans生殖腺マイクロインジェクション。 注: マイクロインジェクション プロトコル Mello および火57から適応され、60,61詳細他の場所で説明されています。 インジェクション顕微鏡上にマウントされたワームと coverslip の場所。低倍率 (5 X 目標、10 X 眼)、下で注射針に垂直のワームを配置します。 高倍率 (40 × 対物、10 X 眼) への切り替えは、核で半ば-に後半-pachytene 付近に対応する生殖腺の腕に隣接する針を再配置します。 マニピュレーターを使用すると、キューティクルを少し憂鬱、ワーム針に移動します。その後、片方の手でキューティクルを針の衝撃を顕微鏡ステージ サイドをタップします。インジェクション ペダル/ボタンを押すとゆっくり注入ミックスで生殖腺の腕を埋めるし、針を抜きます。 その他の生殖腺の腕でこの手順を繰り返します。 ワームを注入すると、一度 coverslip/アガロース パッドを取り外して、解剖顕微鏡の下に置きます。 その上 M9 バッファーをピペッティングによるワームから油を転置する引っ張られた毛細管ピペットを使用して。この処理では、寒天からワームを解放します。 10 分後、ワームは、バッファーでどたばたがときに、移動する NG 寒天 OP50 細菌引っ張られた毛細管ピペットを使用して。ワームに入れました、周りに移動するまで 2-3 h の 20 ° C でプレートを配置します。 回復、一度個別に OP50 で NG 寒天にワームを転送し、プレートを 25 の ° C の定温器に転送します。 P0を許可する-に成長し、3 日間の子孫を置くワームを注入します。画面 F1の子孫。 Co CRISPR または共同変換62,を使用して,636465,,は検診参照の遺伝子の突然変異体の表現型があるかどうかに基づいて候補ワームを選択します。個別に転送 OP50 で NG 寒天プレートに新しいこれらのマークされたワームと 20 ° C で F2子孫を産むことができます。注: co CRISPR スクリーニングまたは選択範囲に使用される表現型は、Cas9 編集の成功のため初期見積もりを提供する必要があります。 Co CRISPR 表現型が存在しない場合は、マイクロインジェクション効率を向上させる支援するために肯定的な制御プラスミドを microinject します。注: たとえば、エンコード タグ付きの mCherry 墓 2 注入ミックスでプラスミドを含む役立つ注入効率を評価します。正常に pCFJ90 を注入したワームでお越しの際にも蛍光咽頭といくつかの子孫。 必要な編集の有無を F1ワームを確認します。96 ウェル プレートの個々 の井戸に F1母を選ぶ、彼女を溶解し、挿入特定の pcr、dna 塩基配列解析、測量ヌクレアーゼ アッセイ (セル 1)66のいずれかで彼女の DNA を確認します。注: co CRISPR/共同 conversion または他のスクリーニングまたは選択制度65,66,67,68を使用する場合は、これらの試金を実行できます。 編集の成果を評価する方法については、手順 8 に進みます。 6. P. hawaiensis準備 前日、マイクロインジェクションを前夜; ペア タンクを設定して初期胚の豊か新しく分離女性新鮮な受精胚が含まれます。Rehmらを参照してください。詳細については69 。 マイクロインジェクションの日、単一セルParhyale胚を収集 (0-4 h 後受精) 海水中の 0.02% チョウジ油妊娠女性を麻酔して炎プルを使用して彼女の腹の育児嚢から胚を軽くこすると丸みを帯びたガラス ピペットと #3 鉗子の鈍いペア。 7. P. hawaiensis胚マイクロインジェクション結合と投与後のケア バックフィル RNP 注入ミックス約 1 μ L で引っ張られたキャピラリー チューブは上記。 Rehmらで説明するように、それぞれの胚を microinject に圧縮された窒素を使用します。69。 マイクロおよびマイクロマニピュレーターを使用して解剖顕微鏡の下でParhyale胚を注入します。引っ張られたキャピラリー チューブ (フィラメント、装置を引っ張ってマイクロ ピペットを使って引くと 4 インチ-1.0 mm) の背面に注入ミックス 1.5 μ を読み込む microloader ピペット チップを使用しています。 注射器の針を設定し、切り裂くスコープ下ピンセットのペアを使用して (ごく少量) 針の先端を破る。ハロカーボン油 700 に注入して、気泡の直径を測定によって提供されるボリュームを調整します。 かみそりの刃を使用して硬化剤のうち「トラフ」をカット。フィルター滅菌海水で途中でそれを埋めるし、安定するトラフParhyale胚をラインアップします。 マイクロインジェクション セットアップでは、注入時に鉗子のペアでそれぞれの胚を安定化を用いた胚を注入します。注入後、上半フィルター滅菌海水でいっぱい新鮮な 60 mm ディッシュに胚を転送するのに転送する、ガラス製のピペットを使用します。 1部フォーム 2 細胞胚 (4 〜 6 時間後受精) に既に発生している場合は、両方の割球を注射することによって完全に突然変異体動物を生成します。2 細胞期の合計胸の谷間 FITC または TRITC デキストランと共同、割球を注入し、信号が注入後スコープを解剖蛍光灯の下で単一割球に制限されていることを確認します。 また、2 細胞期 (組織および A P 軸に沿った位置によってほぼ分割左-右) で 2 つの割球の 1 つで、注射することによって ‘ 半分変異体の動物を生成します。 単一細菌層に編集の制限 8 細胞胚 (7.5-9 h 後受精) で 1 つのセルを挿入します。チャンレジらを参照してください。初期の割球系統の地図の70 。 60 mm 培養皿 (皿あたり 25 以上) をぶるぶると震わせながら、’事前酸素’ 水族館バブラーを使用して、フィルター殺菌海水と半いっぱいで胚を孵化させなさい。 湿度を維持し、12 時間の明暗サイクルの 26 ° C の定温器の配置に湿紙タオルと並ぶ緩く密封容器に胚の料理を配置します。 数日おき海水皿をきれいに存続の胚を転送します。注: 彼らがはるかに遅く開発は胚が培養、室温で可能性があります。 解剖し、その場で交配または抗体染色 (参照・ ブラウンらによって発現解析のさまざまな段階で胚を修正71ステージング ガイドの郭清と固定72の in situハイブリダイゼーション73、74を汚す抗体の追加参照)。 タングステン線の曲がった部分を約スレッドによって解剖針を作るインスリンの針の端に長さ 0.5。現在の下で水酸化ナトリウムに針を研ぐ。解剖針のハンドルとして 1 mL 注射器を使用します。 9 パーツ PEM バッファー (パイプ ph 6.95、グリコールエーテルジアミン四酢酸、2 mM、1 mM MgSO4の 0.1 M)、1 パーツ 10 x PBS および 1部 32% の作りたてのソリューションと 3 もガラスの皿の半分の 1 つの井戸を埋める PFA。3-5 胚を皿に置き、流出する卵黄と定着実行を可能にする、安定させるために突くと少し鈍く鋭いタングステン針を使用して、それぞれの胚に小さな穴を突きます。 尖ったタングステン針のペアを使用して、優しくいじめるParhyale胚を取り囲む外側の 2 つの膜。胚をより強固にするための定着剤でそれらを解剖膜除去が難しく、胚に固定になってから膜を保つためにすぐに仕事が。抗体の汚損のための 15-20 分または 40 〜 50 分の in situハイブリダイゼーションのための合計を修正する胚を許可します。 ライブの孵化の画像し形態および行動の表現型分析または修正しより詳細な分析のため、それらを染色します。ノックアウト、トランスジェニックは行 (雛ケアと他の有用な詳細情報のための Kontarakis と Pavlopoulos75を参照) を確立する 2-3 か月で性成熟に孵化を上げます。 8 評価結果を編集 該当する場合は、編集したセルまたは生物の視覚的または機能的な表現型を探します。メモ: このプロセスは、アプリケーションによって広く異なるが、いくつかの例は、上記に関連するプロトコルの手順の最後で説明します。HSPCs 鎌状赤血球の遺伝子変異を修正した後高速液体クロマトグラフィー (図 1A) を使用して区別された赤芽球によってヘモグロビンの産生を分析します。T 細胞の IL-2 受容体遺伝子のノックアウトは表面の汚損によって確認することができ、フローサイトメトリー (図 1B)。線虫 c. エレガンス P. hawaiensisの表現型を評価するために動物の形態と光や蛍光顕微鏡 (数字 1と1 D) で動作を確認します。 効率と生成されたゲノムの編集の種類を決定するには、編集されたセルのプールを溶解し、商業抽出キット21を使用して彼らのゲノム DNA を抽出します。 塩基形成の迅速推定、カットの周りを PCR 増幅少なくとも 200 塩基対サイトし、T7 endonuclease1 を実行 (T7E1)76または測量 (CEL 1 ヌクレアーゼ) アッセイ77。 Cas9 カット サイトまたは成功した HDR で塩基形成が作成または知られている制限サイトを削除、制限の酵素の消化力を使用した編集の効率6の見積もりを検討してください。制限断片長多形 (RFLP) アッセイは、使用する場合、効率を確認する便利な方法をすることができます。 編集効率の定量の正確さは、優勢な編集結果の定量 PCR 増幅を送信標準サンガーの前方および逆のプライマー シーケンスします。注: 単一のクローンまたは有機体の分析、サンガー結果の分析は簡単、図 2Aに示すようです。細胞のプールを分析しは、図 2Bに示すようとオンライン ツール78、クロマト グラムを分析します。 による定量化と編集結果のシーケンス、図 2Cに示すようにディープ シーケンス27,54, を実行します。 オフのターゲット変更、PCR 増幅予測オフのターゲット サイトの特定のセットを評価し、NGS の送信。染色体転座の検出を有効にするには、ガイド seq79または高スループット、転流ゲノム シーケンス (HTGTS)80を実行します。クローンの集団でターゲットを編集の全体像、全ゲノム シーケンス (WGS)81,,8283を実行します。注: は、さまざまな方法がありますの定量化とオフ-ターゲット ゲノム編集、説明さらに様々 なレビュー記事84,85,86の。