Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme
Summary
Burada, canlı genel ve kas-tendon morfogenez gelişim süreçlerinin özellikle yaşam görüntüleme gerçekleştirmek için kullanımı kolay ve çok yönlü bir yöntem mevcut Drosophila pupa.
Abstract
Tendon ve iskelet kasları hayvanlar insanlar kendi vücut parçaları taşımak için de dahil olmak üzere etkinleştirin. Kas morfogenez hayvanlardan insanlara son derece korunmuş. Bu nedenle, güçlü Drosophila modeli sistemi de insan kas Biyoloji için uygulanabilir kas-tendon geliştirme kavramlarını incelemek için kullanılabilir. Burada, biz ayrıntılı olarak nasıl morfogenez yetişkin kas-tendon sistemi kolayca yaşarken, yansıma Drosophila pupa geliştirme tarif. Bu nedenle, yöntemi proteinler, hücre ve fizyolojik çevre dokularda inceleyen sağlar. Yararlı ipuçları ile adım adım protokolüne ek olarak, biz kas-tendon sistemi eğitimi için uygundur fluorescently tagged marker proteinlerin kapsamlı bir genel bakış sağlar. Çok yönlü uygulamalar Protokolü’nün vurgulamak için biz uzun vadeli morfogenetik olayların görselleştirme arasında değişen-saat ve gün-kas seğirmesi gibi kısa süreli dinamik süreçler görselleştirme için zaman ölçeği üstünde meydana gelen örnek Filmler göstermek saniye zaman ölçeğinde meydana gelen. Birlikte ele alındığında, bu iletişim kuralını tasarlayın ve kas-tendon morfogenez olduğu gibi canlı soruşturma için canlı görüntüleme deneyler yapmak için okuyucu etkinleştirmeniz gerekir.
Introduction
Kas-tendon aparatı insanlar kendi vücut parçaları taşımak için de dahil olmak üzere hayvan sağlar. Moleküler yapı taşları olan kas-tendon sistemi son derece korunmuş. Bu nedenle, kas-tendon geliştirme için insan kas biyoloji, örneğin kas morfogenez, kas-tendon eki ve myofibril kendi kendine organizasyon, ilgili kavramları Drosophila melanogaster bir kolayca erişilebilir kullanarak okudu modeli sistemi. Drosophila pupa sistem çeşitli deneysel avantajları vardır. Ne zaman yetişkin kasları oluşur-ilk olarak, Pupa-organizma sesil ve bu nedenle basit-e doğru mikroskop üzerinde bir süre içinde saatler ya da günler görüntü aşamasındadır. İkinci olarak, birçok kasları formu kapatmak yeterli pupa yüzey altında böylece sağlam, kısmen saydam organizma içinde yansıma. Üçüncü olarak, kasları nerede tendon hücreleri ile şekillendirme exoskeleton bağlı oldukları ve doku gerilim inşa kendi doğal ortamlarında soruşturma olmaktır. Bu kas hücre kültürü sistemlerinde mümkün değildir. Ve son olarak, genetik araçları bir bolluk Drosophilaiçinde kullanılabilir. Bunlar arasında belirli hücre tipleri veya vivo içindegörüntüleme için hücre altı yapıları etiketlerine göre izin birçok fluorescently etiketli işaretleri.
Tablo 1 kas-tendon morfogenez çalışmak için kullanılan en önemli işaretleri özetler. 1 GAL4 UAS sistemi kullanarak overexpressed işaretleri içerir ve protein işaretleri2,3,4endogenously etiketli. GAL4 UAS sistemin avantajı işaretleri genellikle kolayca bütün Dağı pupa görüntüsü güçlü bir sinyal sonuçlanan yüksek düzeyde ifade olmasıdır. Buna ek olarak, doku özgüllük GAL4 sürücüleri dikkatle seçerek elde edilebilir. Füzyon proteinlerin endojen kontrol altında okudu vivo içindeilgili proteinler dinamikleri olabilir iken onlar da işaretleri farklı hücre tipleri veya belirli hücre altı yapıları için kullanılabilir örneğin avantajdır, βps Integrin GFP kas ek siteler için. Birlikte, bu işaretleri deneysel tasarım ve şimdi ve gelecekte çözülebilir araştırma sorunları çeşitli yüksek esneklik sağlar.
| Etiketli yapısı | Marker | İfade ve yerelleştirme | Sınıf | Stok numarası | Yorum | Ref. | ||||||
| Kas | Mef2-GAL4 | Tüm myoblasts ve tüm aşamalarında tüm kasları | GAL4 hattı | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | Yetişkin kas öncüleri ve ≈24 h APF kadar erken myotubes | GAL4 satır, artırıcı tuzak | – | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | kas farklılaşma üzerine atlamak | GAL4 hattı | – | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | ≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları | GAL4 hattı | – | 7 | ||||||||
| Act88F– Cameleon 3.1 | ≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları | Act88F artırıcı / organizatörü sürüş Cameleon 3.1 | – | CA2 + göstergesi | 8 | |||||||
| Act88F-GFP | ≈14 h APF başlayan dolaylı uçuş kasları | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG78 ve fTRG10028 | 4 | ||||||||
| Onu– nls GFP | Yetişkin kas öncüleri, nükleer, ≈24 h APF dolaylı uçuş kaslarda kadar | artırıcı/organizatörü nls-GFP reporter ile | – | 1,5 kb artırıcı parçası | 9 | |||||||
| MHC-Tau-GFP | mikrotübüller DLM şablonlar ve kasları ayırt | artırıcı/organizatörü Tau-GFP reporter ile | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-GFP | mikrotübüller (örneğin kaslarda dolaylı uçuş ≈14 h AFP, güçlü ≈48 h APF sonra azalan) myotubes içinde | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| MHC-GFP (weeP26) | sarcomeres (kalın filaman) tüm vücut kasları (kaslarda ≈30 h APF başlayan örneğin dolaylı uçuş) | GFP-tuzak | – | heterozigoz kullanın, bir izoformu alt etiketleri | 11 | |||||||
| SLS GFP | sarcomeres (Z-disk) tüm vücut kasları (kaslarda ≈30 h APF başlayan örneğin dolaylı uçuş) | GFP-tuzak (sinekkapanı hat) | – | G53, heterozigoz kullanımı | 2 | |||||||
| Zasp66-GFP | Z-disk tüm vücut kasları | GFP-tuzak (sinekkapanı hat) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-GFP | Z-disk tüm vücut kasları | GFP-tuzak (sinekkapanı hat) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| HTS-GFP | aktin bağlama; epitel, myoblasts ve myotubes ifade | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-GFP | epitel hücre kavşaklar, myoblasts ve tüm aşamalarında kaslarda membranlar | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| Kas ek site | βps-Integrin-GFP | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP knock | – | 13 | |||||||
| Talin GFP ve – mCherry | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP-tuzak (taklit satır) | – | 3 | ||||||||
| Talin GFP | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP-füzyon (sinek TransgeneOme hat) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| İlk-GFP | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP-tuzak (sinekkapanı hat) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| Vinc-GFP ve – RFP | kas ek siteler (örneğin, başlangıç ≈18 h AFP dolaylı uçuş kaslarda) | GFP-füzyon (transgene) | – | 13 | ||||||||
| Tendon | SR-GAL4 | pupa aşaması boyunca Toraks tendon hücreleri | GAL4 satır, artırıcı tuzak | BL 26663 | homozigoz öldürücü | 14 | ||||||
| Kas ve Tendon | Duf-GAL4 | kas ve epiteli, erken başlangıçlı | GAL4 hattı | BL 66682 | kirre-rP298, kurucusu hücre işaretçisi | 15 | ||||||
| UAS-muhabirler | UAS– GFP-Gma | aktin bağlama | UAS hattı | BL 31776 | aktin bağlayıcı etki Moesin, GFP için erimiş | 16 | ||||||
| UAS– mCherry-Gma | aktin bağlama | UAS hattı | – | MCherry için erimiş Gma | 17 | |||||||
| UAS- Lifeact-GFP | aktin bağlama | UAS hattı | BL 35544 | 18 | ||||||||
| UAS– Lifeact-Ruby | aktin bağlama | UAS hattı | BL 35545 | 18 | ||||||||
| UAS-CD8-GFP | membran bağlama | UAS hattı | çeşitli hisse senetleri, örneğin: BL 32184 | 19 | ||||||||
| UAS-CD8-mCherry | membran bağlama | UAS hattı | BL 27391 ve 27392 | 20 | ||||||||
| UAS-palm-mCherry | membran bağlama aracılığıyla palmitoylation | UAS hattı | BL 34514 | UAS– brainbow | 21 | |||||||
Tablo 1: Fluorescently protein işaretleri kas-tendon morfogenez vivo içindeçalışmak için uygun ekledi.
Burada, kolayca ve başarılı bir şekilde yaşayan pupa kas-tendon morfogenez görüntüleme nasıl yapılabilir biz ayrıntılı olarak tarif (şekil 1). Alternatif olarak, Pupa sabit olabilir, disseke ve aynı zamanda proteinler işaretleri Hayır canlı için etiketlemek için antikorlar kullanarak sağlar immunostained çoğu kullanılabilir22. Bu durumda, hiçbir hareket ve faiz yapısı coverslip yakın yerleştirildiğinden genellikle daha yüksek görüntü kalitesi. Ancak, diseksiyon ve fiksasyon hasar ve moleküler açabilir veya doku dinamikleri, örneğin, kas seğirmesi, sadece canlı organizma okudu olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan Protokolü kas-tendon morfogenez yaşayan görüntü açıklar Drosophila pupa fluorescently tagged proteinler çeşitli kullanarak. Bu strateji Imaging vivo içinde gelişimsel süreçleri tüm organizmanın doğal ortamda eğitim için kullanılabilir.
Bu analiz etmek için doğru gelişim süresi noktası bulmak başarılı bir deneme için çok önemlidir. Örneğin, karın kasları daha sonra geliştirirken ve sadece 30 ve 40 h APF26arasında her iki ucundaki eklemek dorsolongitudinal dolaylı uçuş kasları tendon hedeflerine ≈16 h APF23 eki başlatın. Sonuç olarak, önceden yayınlanmış edebiyat geliştirme analiz etmek için doğru zaman noktaları bulmak için kullanılması gereken veya doku veya faiz yapısını ayrıntılı önce araştırılmamıştır, genel geliştirme ilk karakterize edilebilir vardır.
Özel olarak oluşturulmuş plastik slaytlarda başarıyla montaj pupa için bu oluklar uygun boyutlara sahip önemlidir: 1.0-1.5 mm geniş ve 0.3 – oluklar gerek 0.4 mm derin. Bu derinliği ile gerektiği gibi yer açıcı coverslips üst coverslip kesin Uzaklik ayarlama sağlar. Ancak, en az bir boşluk ekleyici coverslip % 50 gliserol örnek uzak boşaltma önlemek için kılcal kuvvetler tarafından kullanılmalıdır. Oluk içinde pupa doğru konumlandırma bazı deneyim ve faiz yapısı coverslip için mümkün olduğu kadar yakın olacak optimize edilmelidir gerektirir.
Pupa, çok sayıda bir mikroskop oturumda yansıması gerekiyordu eğer onlar tüm önceden monte edilebilir ve daha sonra bir kuluçka makinesine uygun gelişim zamanlaması sağlamak için Imaging kadar saklı. Pupa yordamın tamamını hayatta kalmak ve ayrıca en az eclose için slayt üzerinde görüntüleme sonra devam deneyin. Sağkalım oranı bir okuma görüntüleme koşulları pupa zarar olup olmadığını kontrol etmek için kullanılabilir.
Görüntüleme ayarları dikkatle deneysel gereksinimlerine göre seçilmelidir. Kısa süreli filmler için yüksek kare hızı yüksek sinyal gürültü oranı karşı dengeli olabilir nispeten yüksek lazer güç-ebilmek var olmak kullanılmış pupa çok fazla zarar vermeden süre gerekiyor. Ancak, uzun vadeli Filmler, lazer gücü makul ses seviyelerinde tutulmalıdır ve pupa sürekli ziyade belli zaman noktalarda, örneğin, her 20 dk yansıması değil. Faiz yapısını görüş alanı dışında hareket etmez emin olmak için z-yığın zaman puan arasında konumlandırılması yeniden düzenlemek gerekli olabilir. Bilgimizi, Pupa dava açılması gelişimsel zamanlama başına etkilemez. Ancak, ısı kontrollü bir sahne uzun vadeli filmler için uygun gelişim zamanlaması sağlamak için kullanılmalıdır. Bu noktalar göz önünde tutulduğunda, son derece bilgilendirici Filmler elde edilebilir.
Sunulan protokolü hem de diğer gelişmekte olan dokular, örneğin, kanat epitel29kas-tendon morfogenez görselleştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü yalnızca üç değişiklikler gereklidir: (1) yerine göğüs veya karın kanat yukarıda pupa davanın açılması, (2) pupa en iyi coverslip ve (3) doğru kanat ile farklı floresan marker proteinler kullanımı konumlandırma. Drosophila30,31 yılında endojen loci hedeflemek daha basit hale gelmiştir çünkü CRISPR/Cas9-teknoloji ilerlemesi ile daha fazla endogenously tagged floresan proteinler, kullanılabilir , 32. gelecekte, bu çok sayıda proteinler, hücre ve fizyolojik çevreleri ayrıntılı olarak tüm dokularda dinamikleri elucidating izin verir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Manuela Weitkunat film S3 edinimi için teşekkür ederiz. Cömert desteği Reinhard Fässler için sana şükrediyoruz. Bu eser tarafından EMBO Young araştırmacı programı (F.S.), Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği’nin yedinci çerçeve programı (FP/2007-2013) altında desteklenen / ERC Grant 310939 (F.S.), Max Planck toplum (S.B.L., F.S.), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), mükemmellik girişimi Aix-Marseille Üniversitesi AMIDEX (F.S.) LabEX BİLGİLENDİRMEK (F.S.) ve Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Materials
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | – | – | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | – | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).
- Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
- Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).
- Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124 (17), 3333-3341 (1997).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).
- Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).
- Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).
- Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).
- Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
- Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).
- Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).
- Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).
- Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).
- Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135 (4), 621-626 (2008).
- Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
- Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
- Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).
- Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).
- Classen, A. -. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4 (12), 2409-2418 (2014).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
