生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

イメージ体内のハエの蛹、大人器官の形態形成の研究に理想的なモデル システムを作るそれらの開発に様々 な組織ができます。これらのうち、間接飛翔筋、腱細胞を含む胸部上皮、翼上皮、腹部の筋肉と心臓22,23,24,25,26,27します。 ここでは、筋肉や腱の形態のライブ イメージングに着目。間接飛翔筋や腹部の筋肉の形態形成とショウジョウバエ筋生物学を勉強するための追加のメソッドの詳細については、我々 は Weitkunat、いそうろう 2014年22に読者を参照してください。 間接飛翔筋のライブ イメージング 留学 dorsolongitudinal 筋肉 (DLMs) や卵割の筋肉 (獣医師向け) に GFP (UA-GFP-Gma) 球状モエシン アクチン結合ドメインのタグから成る間接飛翔筋の長期的な開発はすべてに表現されました。心筋増強因子 2 (Mef2)を使用しての筋肉-GAL4 ドライバー (図 2 a-d、映画 S1)。イメージング前、蛹の場合ウィンドウは図 1 fに示すように、胸郭上開かれました。2 光子顕微鏡 z スタック蛹殻形成過程 (11 h APF) 後 ≈11 h から始まる 21 時間 20 分毎に買収されました。この時期、DLMs に (図 2 aでオーバーレイをグリーン’-D’) 腱細胞 (図 2 a) に添付ファイルを開始し、一方、中高年の筋肉の添付ファイル (図 2 b) を分割します。次に、最終的に 30 h APF (図 2 D) で最大限に締固めの段階に達するまで、乏しくは (図 2) を短きます。一緒に取られて、この映画は、時間のタイム スケール上で発生する筋群の形態の劇的な変化を強調表示します。 図 2: 間接飛翔筋および腱の損傷形態のイメージングのライブします。(A ~ D)時間Mef2を用いた 2 光子映画 (映画 S1) からポイント-GAL4、UAS- GFP-Gma dorsolongitudinal 筋肉から成る間接飛翔筋アクチンのマーカーとして (Dlm で緑色で強調表示 ‘-D’) と背の筋肉 (メモリサーバ、A に青色で強調表示 ‘-D’)。スケール バーは、100 μ m の範囲(E H)時間からポイントDufを用いた 2 光子映画 (映画 S2)-GAL4、UAS-CD8-間接飛翔筋の腱細胞を含む胸部上皮マーカーとして GFP。パネル E’-H’ 筋肉 (緑) と接触して腱上皮 (マゼンタ) によって形成された長い携帯電話の拡張子を強調表示各時点で筋腱のシステムのモデルをオーバーレイを表示します。スケール バーは、100 μ m (イメージ構造のサイズから推定) です。(私は-L)筋腱の添付ファイルの開始に焦点を当て、2 色回転ディスク共焦点ムービー (映画 S3) からポイントを時間します。腱細胞がsr付け-GAL4、UAS-ヤシ-mCherry (マゼンタ) と dorsolongitudinal の間接飛翔筋のMhc-タウ GFP (緑) と。スケール バーは、10 μ m. 時間として示される hh:mm 蛹殻形成過程 (APF) の後。温度制御の段階に買収されたすべての映画、発生時期発散したがって、ことに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 同時に腱や筋の形態を研究するため膜結合型 GFP (UA-CD8-GFP) を使用して表現されたDumbfounded (Duf)-、腱細胞と間接飛翔筋 (図 2 e の両方に表現されるドライバーとして GAL4 -H で、映画 S2)。Z スタックは 20 時間 16 h APF から 20 分毎、2 光子励起顕微鏡で撮影されました。乏しくコンパクトながら (図2 e の緑のオーバーレイ’-H’)、腱細胞とともに細長いフォーム長い細胞拡張機能 (図2 e マゼンタ オーバーレイ’-H’)。一緒に取られて、この映画は、腱と筋肉細胞体内間の近い相互作用を強調表示します。 筋腱の相互作用の詳細を調べるためには、2 色、高倍率のイメージングを行った.ミオシン重鎖 (Mhc)と蛹-タウ-DLMs とUASの GFP パルミトイル-mCherry (UA-ヤシ-mCherry) によって駆動されるストライプ (sr)-腱の GAL4 は回転する円盤上で 4.5 時間 12 h APF から 5 分ごとをイメージしました共焦点顕微鏡 (図 2I-L は、映画 S3)。12 h で APF、乏しくは彼らのヒント (図 2 i) で長い糸状を形成しながら、腱の標的細胞へ移行します。その後、筋肉や腱組織され (図 2 j, K) 安定した添付ファイルを形成します。添付ファイルするにつれて、少ない糸状形態と筋腱インターフェイス (図 2 L) を滑らか。したがって、くわしくは生きている有機体の細胞動態を明らかにするため 2 色、高倍率の画像を使用できます。 腹部の筋肉のライブ イメージング (図 3、映画 S4)、腹部の筋肉のライブ イメージングMef2-GAL4> UA-CD8-GFP はマーカーとして使用され、ウィンドウで詳細図 1として蛹の場合腹部の上開設。図 2 aDで表される間接飛翔筋の映画と同様に、形成し、腹部の筋肉の成長続くことができる開発 (映画 S4 で 55 h) の多くの時間を。この時間の間に、筋芽細胞は成長する (図 3 a) であるフォームにヒューズします。筋のヒントを腱ターゲットに移行、腱細胞にアタッチした後、サルコメアの筋肉の収縮単位が形成される (図 3 bD)。 図 3: 腹部の筋肉の形態形成の画像をライブします。(A ~ D)時間Mef2を使用してムービー (映画 S4) からポイント-GAL4、UAS-CD8-腹部の筋肉の形態形成に従うマーカーとして GFP。パネル A’-E’ 蛹のステージの間にde novoを形作る腹筋セット (緑) のモデルのオーバーレイを表示します。スケール バーは、100 μ m。 時刻は hh:mm APF として示されます。映画は、室温で買収されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 筋肉のけいれんのライブ イメージング 異なり、図 2 図 3図 4に示す秒の時間スケールで発生する筋肉のダイナミクス: 筋収縮のライブ録音。内因性制御の下で βPS インテグリン gfp 蛹 0.65 の時間分解能撮像した共焦点顕微鏡 (映画 S5) に 1 つの z 平面で s。図 4の表示例では、42 h APF から始まる 10 分間 3 メモリサーバ (図 4 a) の添付ファイルのサイトをイメージしました。この時間の間に 5 つの収縮の事象は観察 (図 4 b-F)、サルコメアの開発のこの時点で調整された収縮をサポートする十分既に組み立てを示します。したがって、筋肉のけいれんのイメージングは、既に間接飛翔筋開発28羽化後のみ実行できますたとえば飛行のテストとは対照的の間のプロセス sarcomerogenesis の機能的な読み出しとして使用できます。 図 4: 筋肉のけいれんのイメージングを住んでいます。(A)マーカーとして βPS-インテグリン-GFP を 42 h APF を使用して卵割間接飛翔筋のけいれんを示す映画 (映画 S5) から最初時点。ビューのフィールドは、筋肉 DVM II 2、DVM III 1、DVM III 2 の添付ファイルのサイト。(B F)色 5 つの個々 の筋線維のイベントのオーバーレイ (マゼンタ) の収縮前に、のフレームと収縮イベント (緑) の最初のフレームを表示します。個々 の筋線維は収縮独立して互いに注意してください。矢印は、けいれんの動きを強調表示します。映画の時間分解能は 0.65 s. スケール バーは、25 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。 タグ内因蛋白質のライブ イメージング ΒPS に似ています-インテグリン-GFP、ショウジョウバエの内因性制御の下で表現の融合蛋白質の大規模なコレクションは、生成された2,3、4をされています。これらのフライラインは、たとえば細胞レベル下のローカリゼーションや興味の蛋白質の発現を研究する使用できます。コレクションは、特定の抗体が利用できないまたは蛋白質の原動力を調査生体内で固定せずする必要がある場合に特に便利です。図 5は、フライの TransgeneOme (fTRG) ライブラリ、胡李泰紹 (Hts) から内生に表現された融合タンパク質の 3 つの例を示しています-GFP (図 5 a, B)、タリン GFP (図 5D) と βTubulin60D GFP (図 5 e, F)。当然のことながら、それらを表現するすべての組織にこれらの蛋白質の表現を学ぶことができます。ここでは、例として胸郭の上皮 (図 5 a、C、E) や間接飛翔筋の付着部位 (図 5 b, D, F) を表示します。 図 5: 蛋白質のタグ内因のライブ イメージングします。(B)Z スタック Hts gfp 蛹の撮影の最大の予測。(C, D)Z スタック タリン gfp 蛹の撮影の最大の予測。(E, F)Z スタック蛹 βTubulin60D gfp の撮影の最大の予測。パネル A、C および E それぞれ、18、24、18 h、APF で胸郭上皮を表示し、パネル B、D および F 間接飛翔筋または 30 h APF での添付ファイルのサイトを表示します。スケール バーは、25 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。