In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Vari tessuti possono essere imaged in vivo nello sviluppo pupe volare, che li rende un sistema modello ideale per studiare la morfogenesi di organi adulti. Tra questi sono i muscoli di volo indiretto, l’epitelio di torace, comprese le cellule del tendine, l’epitelio dell’ala, muscoli addominali e il cuore22,23,24,25,26 , 27. qui, ci concentriamo su formazione immagine dal vivo della morfogenesi del muscolo e tendine. Per una descrizione dettagliata del muscolo voli indiretti e morfogenesi dei muscoli addominali e ulteriori metodi per lo studio della biologia del muscolo in Drosophila, rimandiamo il lettore a Weitkunat e Schnorrer 201422. Live imaging dei muscoli di volo indiretto Per studiare lo sviluppo a lungo termine dei muscoli del volo indiretto che consiste dei muscoli dorsolongitudinal (DLMs) e i muscoli dorsoventral (DVMs), moesina globulare actina-associazione dominio contrassegnato con GFP (UAS -GFP-Gma) è stata espressa in tutte le i muscoli utilizzando il fattore di rinforzatore del Myocyte 2 (Mef2)-GAL4 driver (Figura 2A-D, Film S1). Prima di formazione immagine, è stata aperta una finestra nel caso pupal sopra il torace come mostrato in Figura 1F. Su un microscopio a due fotoni, z-stack sono stati acquisiti ogni 20 min per h 21 a partire da ≈11 h dopo la formazione del pupario (11h APF). In questo lasso di tempo, la DLMs (verde sovrapposizioni nella Figura 2A’-D’) prima di avviare collegamento alle cellule del tendine (Figura 2A) e quindi di dividere mentre gli allegati muscolari mature (Figura 2B). Successivamente, i miotubi accorciano (Figura 2) fino a raggiungere infine la fase compattata al massimo a 30 h APF (Figura 2D). Presi insieme, questo film mette in evidenza i drammatici cambiamenti nella morfologia del muscolo che si verificano sulla scala del tempo di ore. Figura 2: Live imaging della morfogenesi di muscolo e tendine di voli indiretti. (A-D) Punti da un filmato di due fotoni (film S1) utilizzando Mef2tempo-GAL4, UAS- GFP-Gma come marcatore per l’actina nei muscoli del volo indiretto che consiste dei muscoli dorsolongitudinal (DLMs, evidenziata in verde nell’A ‘-D’) e la (muscoli dorsoventral DVMs, evidenziata in blu nell’A ‘-D’). Barre della scala sono 100 µm. (E-H) tempo punti da un filmato di due fotoni (film S2) utilizzando Duf-GAL4UAS-CD8-GFP come indicatore per i muscoli di volo indiretto e l’epitelio di torace compreso le cellule del tendine. Pannelli E’-H’ mostrare una sovrapposizione con un modello del sistema muscolo-tendinee in ogni punto del tempo, evidenziando le estensioni lungo cellulare formata dall’epitelio del tendine (magenta) a contatto con i muscoli (verde). Barre della scala sono 100 µm (stimato dalla dimensione delle strutture imaged). (I-L) Tempo punti da un film di confocal di due colori, filatura disco (film S3) concentrandosi sull’iniziazione allegato muscolo-tendinee. Le cellule del tendine sono etichettate con sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) e il dorsolongitudinal indiretta volo muscoli con Mhc -Tau-GFP (green). Barre della scala sono 10 µm. tempo è indicato come HH: mm dopo formazione pupario (APF). Si noti che non tutti i film sono stati acquistati su un palco a temperatura controllata, pertanto, può divergere tempistica inerente allo sviluppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Per lo studio della morfogenesi del tendine e del muscolo allo stesso tempo, membrana-limita GFP (UAS -CD8-GFP) è stato espresso utilizzando Dumbfounded (Duf)-GAL4 come un driver, che si esprime sia nelle cellule del tendine e i muscoli di volo indiretto (Figura 2E -H, film S2). Uno z-stack è stata presa su un microscopio a due fotoni ogni 20 min a partire a 16 h APF per 20 h. Mentre i miotubi compatto (sovrapposizione verde in Figura 2E’-H’), il tendine cellule estensioni lungo cellulare modulo che allungano con tempo (magenta sovrapposizione in Figura 2E’-H’). Presi insieme, questo film mette in evidenza la stretta interazione tra il tendine e muscolo cellule in vivo. Per studiare l’interazione muscolo-tendinee più in dettaglio, due colori, ad alto ingrandimento imaging è stata eseguita. Pupe con catena pesante della miosina (Mhc)-Tau-GFP nella DLMs e UAS -palmitoilazione-mCherry (UAS -palm-mCherry) guidato da striscia (sr)-GAL4 nei tendini erano imaged ogni 5 min a partire da 12 h APF per 4,5 h su un disco che gira microscopio confocale (Figura 2I-L, film S3). A 12 h APF, i miotubi migrano verso loro cellule bersaglio del tendine formando lungo filopodi sulla loro punta (Figura 2I). Successivamente, i muscolo e tendine tessuti interdigitazione (Figura 2J, K) per formare un collegamento stabile. Come l’allegato matura, meno filopodi modulo e l’interfaccia muscolo-tendinee leviga (Figura 2 L). Così, due colori, ad alto ingrandimento imaging consente di rivelare la dinamica cellulare in dettaglio nell’organismo vivente. Live imaging dei muscoli addominali Per formazione immagine diretta dei muscoli addominali (Figura 3film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP è stato usato come un indicatore e una finestra è stata aperta sopra l’addome nel caso pupal come descritto in dettaglio nella Figura 1. Simile al film di muscolo voli indiretti rappresentato in Figura 2A-D, la formazione e la crescita dei muscoli addominali possono essere seguite su molte ore di sviluppo (55H nel film S4). Durante questo periodo, i mioblasti fusibile per formare miotubi (Figura 3A) in crescita. I suggerimenti di miotubi migrano verso i loro obiettivi di tendine, e dopo il collegamento per le cellule del tendine, si formano le unità contrattile dei muscoli, i sarcomeri, (Figura 3B-D). Figura 3: Live imaging della morfogenesi del muscolo addominale. (A-D) Punti da un filmato (Movie S4) utilizzando Mef2tempo-GAL4UAS-CD8-GFP come marcatore di seguire la morfogenesi dei muscoli addominali. Pannelli A’-E’ mostrare sovrapposte con modelli di un insieme di muscoli addominali (verde) che si forma de novo durante la fase di pupa. Barre della scala sono 100 µm. tempo è indicato come HH: mm APF. Il film è stato acquisito a temperatura ambiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Live imaging di contraendo i muscoli In contrasto con la Figura 2 e Figura 3, Figura 4 Mostra dinamiche muscolari che si verificano sulla scala del tempo di secondi: la registrazione dal vivo di contrazioni muscolari. Pupe esprimendo βPS-integrina-GFP sotto controllo endogeno erano imaged con una risoluzione temporale di 0.65 s in un unico piano z su un microscopio confocale (Film S5). Nell’esempio visualizzato nella Figura 4, i siti di collegamento di tre DVMs (Figura 4A) erano imaged per 10 min a partire da 42 h APF. Durante questo tempo, twitch cinque eventi sono stati osservati (fig. 4B-F), mostrando che i sarcomeri sono già assemblati abbastanza bene per sostenere sviluppo coordinate contrazioni in questo momento. Quindi, imaging di contrazioni muscolari può essere utilizzato come una lettura funzionale per sarcomerogenesis già durante lo sviluppo del muscolo voli indiretti28, al contrario ad esempio prove di volo, che può essere eseguita solo dopo eclosion. Figura 4: Live imaging di contraendo i muscoli. (A) primo tempo-punto da un filmato (Movie S5) mostrando contrazioni dei muscoli dorsoventral voli indiretti alle 42h APF utilizzando βPS-integrina-GFP come indicatore. Nel campo di vista è il muscolo allegato siti DVM II 2, DVM III 1 e DVM III 2. (B-F) Colore sovrapposizioni di cinque eventi di twitch individuali, ognuna mostrando il telaio prima della contrazione (magenta) e il primo fotogramma dell’evento twitch (verde). Si noti che le singole fibre di muscolo contrarsi in modo indipendente gli uni dagli altri. Le frecce evidenziano il movimento contrazioni. La risoluzione di tempo del film è 0,65 s. barre della scala sono 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Live imaging di proteine etichettate in modo endogeno Simile a βPS-integrina-GFP, una grande collezione di proteine di fusione espressa in Drosophila sotto controllo endogeno è stato generato2,3,4. Queste linee di volare possono essere utilizzate per studiare ad esempio la localizzazione subcellulare o i profili di espressione di proteine di interesse. La collezione è particolarmente utile se gli anticorpi specifici non sono disponibili o proteina dinamiche devono essere studiati in vivo senza fissazione. Figura 5 vengono illustrati tre esempi di proteine di fusione in modo endogeno espresse dalla libreria TransgeneOme (fTRG) Vola, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figura 5A, B), Talin-GFP (Figura 5, D) e βTubulin60D-GFP ( Figura 5E, F). L’espressione di queste proteine può essere studiata in tutti i tessuti che li esprimono naturalmente. Qui, indichiamo l’epitelio del torace (Figura 5AC, E) e i muscoli di volo indiretto o loro siti allegato (figura 5BD, F) come esempi. Figura 5: Live imaging di endogenamente etichetta proteine. (A, B) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo Hts-GFP. (C, D) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo la Talin-GFP. (E, F) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo βTubulin60D-GFP. Pannelli A, C ed E mostrare l’epitelio del torace a 18, 24 e 18 h APF, rispettivamente e pannelli B, D e F mostrare i muscoli di volo indiretto o loro siti allegato a 30 h APF. Barre della scala sono 25 µm. 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