אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשימוש, רב-תכליתי לביצוע חי הדמיה של תהליכים התפתחותיים מורפוגנזה הכללי של גיד השריר בפרט חי הגלמים דרוזופילה .
Abstract
השרירים יחד עם הגידים, השלד מאפשרים בעלי חיים, כולל האדם כדי להעביר חלקי גופם. מורפוגנזה שריר מאוד כולו מבעלי חיים לבני אדם. לכן, שיטת מודל דרוזופילה ניתן ללמוד מושגים של פיתוח שרירים-הגיד כי ניתן להחיל גם הכוח האנושי לביולוגיה. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט איך מורפוגנזה של מערכת השריר למבוגרים-הגיד יכול בקלות לדימות חיי, פיתוח הגלמים דרוזופילה . לפיכך, השיטה מאפשרת לחקור חלבונים, תאים ורקמות בסביבה הפיזיולוגית שלהם. בנוסף פרוטוקול צעד אחר צעד עם עצות מועילות, אנו מספקים סקירה מקיפה של חלבונים סמן מתויגות fluorescently המתאימים הלומדים מערכת השריר-גיד. כדי להבליט את היישומים תכליתי של הפרוטוקול, אנחנו מקרינים סרט דוגמה החל ויזואליזציה של אירועים morphogenetic לטווח ארוך – המתרחשים על ציר הזמן של שעות וימים – כדי ויזואליזציה של תהליכים דינאמיים לטווח קצר כמו רעד שרירי המתרחשים סרגל זמן של שניות. יחדיו, פרוטוקול זה צריך לאפשר לקורא לעצב ולבצע הדמיה לחיות ניסויים על חקירת גיד השריר מורפוגנזה באורגניזם ללא פגע.
Introduction
המנגנון גיד השריר מאפשר בעלי חיים, כולל האדם כדי להעביר חלקי גופם. אבני הבניין מולקולרית של מערכת השריר-גיד מאוד נשמרים. לכן, המושגים של גיד השריר פיתוח שרלוונטית הכוח האנושי ביולוגיה, לדוגמה מורפוגנזה שריר, גיד השריר המצורף, ארגון עצמי myofibril, ניתן יהיה ללמוד באמצעות דרוזופילה melanogaster כמו נגישה בקלות מערכת מודל. מערכת הגולמי דרוזופילה יש מספר יתרונות ניסיוני. ראשית, על השלב הגולמי – כאשר השרירים למבוגרים נוצרות – האורגניזם הוא sessile וקל לכן תמונה על מיקרוסקופ על פני תקופה של שעות או אפילו ימים. שנית, רבים טופס השרירים קרוב מספיק מתחת לפני השטח הגולמי כך הם יכולים לדימות בתוך האורגניזם ללא פגע, שקוף חלקית. שלישית, השרירים יכול ייחקרו בתוך הסביבה הטבעית שלהם, הם מחוברים ויוצרים שלד חיצוני באמצעות גיד תאים בהם המתח רקמות נבנית. . זה לא אפשרי במערכות תרבות תא השריר. לבסוף, שפע של כלים גנטיים זמינה בדרוזופילה. בין אלה הם סמנים מתויגות fluorescently רבות המאפשרות תיוג של סוגי תאים מסוים או מבני subcellular עבור דימות in vivo.
טבלה 1 מסכמת את סמני החשוב ביותר עבור מורפוגנזה גיד השריר. זה כולל סמני overexpressed באמצעות ה GAL4-UAS-מערכת1 ו מתויג endogenously חלבון סמני2,3,4. היתרון של GAL4-UAS-המערכת הוא כי סמני מתבטאים בדרך כלל ברמה גבוהה, וכתוצאה מכך אות חזק זה יכול בקלות לדימות בכולה-הר הגלמים. בנוסף, ירידה לפרטים רקמות יכולה להיות מושגת על-ידי בחירה GAL4 נהגי בזהירות. היתרון של חלבונים פיוז’ן לידי ביטוי בשליטה אנדוגני הוא כי הדינמיקה של החלבונים המתאימים ניתן למדה ויוו, בעוד הם יכולים לשמש גם סמנים לסוגי תאים שונים או מבנים subcellular ספציפיים, לדוגמה, ΒPS-אינטגרין-GFP לאתרים המצורפים שריר. . יחד, סמנים אלה מספקות גמישות גבוהה עיצוב ניסיוני, הבחירה של מחקר בעיות יכולות להיפתר עכשיו ובעתיד.
| מבנה עם תוויות | סמן | הביטוי ולוקליזציה | מחלקה | מספר מניות | תגובה | Ref. | ||||||
| שריר | Mef2-GAL4 | כל myoblasts ואת כל השרירים בכל שלבי | GAL4 קו | BL 27390 | 5 | |||||||
| 1151-GAL4 | מבשרי שריר למבוגרים, myotubes מוקדמת עד ≈24 h APF | GAL4 קו, משפר מלכודת | – | 6 | ||||||||
| Act79B-GAL4 | לקפוץ שריר על בידול | GAL4 קו | – | 7 | ||||||||
| Act88F-GAL4 | שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF | GAL4 קו | – | 7 | ||||||||
| Act88F– Cameleon 3.1 | שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF | Act88F משפר יזם נהיגה Cameleon 3.1 | – | Ca2 + מחוון | 8 | |||||||
| Act88F-GFP | שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF | GFP-פיוז’ן (קו TransgeneOme לעוף) | fTRG78, fTRG10028 | 4 | ||||||||
| GFP – nls אותו | מבשרי שריר למבוגרים, גרעיני, עד ≈24 h APF בשרירי טיסה עקיף | משפר/יזם עם הכתב nls-GFP | – | פרגמנט משפר 1.5 kb | 9 | |||||||
| Mhc-טאו-GFP | microtubules DLM תבניות, המבדילים השרירים | משפר/יזם עם טאו-GFP כתב | BL 53739 | 10 | ||||||||
| ΒTub60D-GFP | microtubules ב- myotubes (למשל, שרירי תעופה עקיף של ≈14 h AFP, הפחתת בחריפות לאחר ≈48 h APF) | GFP-פיוז’ן (קו TransgeneOme לעוף) | fTRG958 | 4 | ||||||||
| Mhc-GFP (weeP26) | sarcomeres (עבה פילמנט) של כל השרירים בגוף (למשל, שרירי תעופה עקיף החל מ≈30 h APF) | GFP-השמנה | – | השתמש משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, תוויות תת-קבוצה של isoform | 11 | |||||||
| Sls-GFP | sarcomeres (Z-דיסק) של כל השרירים בגוף (למשל, שרירי תעופה עקיף החל מ≈30 h APF) | GFP-השמנה (לגלי קו) | – | G53, שימוש משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים | 2 | |||||||
| Zasp66-GFP | Z-דיסק של כל השרירים בגוף | GFP-השמנה (לגלי קו) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
| Zasp52-GFP | Z-דיסק של כל השרירים בגוף | GFP-השמנה (לגלי קו) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
| . השודדים-GFP | אקטין מחייב; לידי ביטוי אפיתל, myoblasts, myotubes | GFP-פיוז’ן (קו TransgeneOme לעוף) | fTRG585 | 4 | ||||||||
| Dlg1-GFP | צמתי תא אפיתל, myoblasts וממברנות שרירים בכל שלבי | GFP-פיוז’ן (קו TransgeneOme לעוף) | fTRG502 | 4 | ||||||||
| האתר המצורף שריר | ΒPS-אינטגרין-GFP | שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) | GFP-טוק-ב | – | 13 | |||||||
| Talin-GFP ו- mCherry | שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) | GFP-השמנה (לחקות קו) | – | 3 | ||||||||
| Talin-GFP | שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) | GFP-פיוז’ן (קו TransgeneOme לעוף) | fTRG587 | 4 | ||||||||
| אפשריים-GFP | שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) | GFP-השמנה (לגלי קו) | קיוטו 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
| יקבלו-GFP ו- RFP | שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף) | GFP-פיוז’ן (transgene) | – | 13 | ||||||||
| גיד | sr-GAL4 | תאי גיד החזה, לאורך כל השלב הגולמי | GAL4 קו, משפר מלכודת | BL 26663 | homozygous קטלני | 14 | ||||||
| שריר וגיד | Duf-GAL4 | השרירים ואת epithelia, התפרצות מוקדמת. | GAL4 קו | BL 66682 | kirre-rP298, מייסד תא סמן | 15 | ||||||
| UAS-כתבים | UAS– GFP-Gma | איגוד אקטין | קו UAS | BL 31776 | תחום הכריכה אקטין Moesin דבוקה GFP | 16 | ||||||
| UAS– mCherry-Gma | איגוד אקטין | קו UAS | – | Gma דבוקה mCherry | 17 | |||||||
| UAS- Lifeact-GFP | איגוד אקטין | קו UAS | BL 35544 | 18 | ||||||||
| UAS– Lifeact-רובי | איגוד אקטין | קו UAS | BL 35545 | 18 | ||||||||
| UAS-CD8-GFP | איגוד ממברנה | קו UAS | מניות שונות, למשל: BL 32184 | 19 | ||||||||
| UAS-CD8-mCherry | איגוד ממברנה | קו UAS | BL 27391 ו 27392 | 20 | ||||||||
| UAS-דקל-mCherry | ממברנה מחייב דרך palmitoylation | קו UAS | BL 34514 | UAS– brainbow | 21 | |||||||
טבלה 1: מתויגות Fluorescently סמני חלבונים מתאימים ללמוד גיד השריר מורפוגנזה ויוו.
כאן, אנו מתארים בפרוטרוט איך ניתן לבצע הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב חי הגלמים ומוצלחת (איור 1). לחלופין, ניתן לתקן הגלמים, גזור, immunostained, אשר מאפשר באמצעות נוגדנים לתייג גם חלבונים אשר לא גרה סמני הינם זמינים22. במקרה זה, איכות הדמיה היא בדרך כלל גבוה יותר כי יש תנועה, ניתן למקם את המבנה של עניין בסמיכות coverslip. אולם, ניתוח של קיבוע יכול להוביל לנזק ומולקולרית או דינמיקה רקמות, לדוגמה, עוויתות שרירים, יכול להילמד רק בתוך האורגניזם החי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול הציג מתאר כיצד תמונת גיד השריר מורפוגנזה חי הגלמים דרוזופילה באמצעות מגוון של חלבונים fluorescently מתויגות. זה ויוו הדמיה אסטרטגיה יכול לשמש כדי לחקור תהליכים פיתוחיים בסביבתם הטבעית של האורגניזם כולו.
זה הכרחי עבור ניסוי יירוט מוצלח לאתר את הנקודה הנכונה זמן התפתחותית לנתח. לדוגמה, שרירי תעופה עקיף dorsolongitudinal ליזום מצורף אל המטרות שלהם גיד-≈16 h APF23 בזמן שרירי הבטן לפתח מאוחר יותר ולצרף משני הכיוונים רק בין 30 ל-40 h APF26. כתוצאה מכך, ספרות שפורסמו קודם לכן יש להשתמש כדי למצוא את הנקודות בזמן הנכון של פיתוח לנתח או, אם רקמות או מבנה עניין לא נחקרה בהרחבה בעבר, ההתפתחות הכללית חייב להיות מאופיין קודם.
על הגלמים הרכבה בהצלחה בשקופיות פלסטיק לפי הזמנה, חשוב החריצים שיש מידות מתאים: חריצים צורך להיות 1.0-1.5 מ מ רחב ו- 0.3 – 0.4 מ מ עמוק. לעומק הזה מאפשרת כוונון המרחק המדויק coverslip העליון עם מרווח coverslips כנדרש. עם זאת, coverslip מרווח אחד לפחות אמור לשמש כדי למנוע ייבוש של גליצרול 50% מן המדגם על-ידי כוחות נימי. למקם נכון את הגלמים ב- groove דורש קצת ניסיון צריך להיות מותאם כזה כי המבנה של עניין הוא הכי קרוב ככל האפשר כדי coverslip.
אם מספר גדול של הגלמים אמור לדימות בהפעלה מיקרוסקופ אחד, הם יכולים כל להיות מותקן מראש, ולאחר מכן מאוחסנים בתוך אינקובטור עד הדמיה כדי להבטיח תזמון התפתחותי תקין. הגלמים עליו לשרוד את כל ההליך, גם לפחות לנסות eclose אם שמר על השקופית לאחר דימות. שיעור ההישרדות יכול לשמש את הבדיקה כדי לבדוק אם התנאים הדמיה לפגוע הגלמים.
ההגדרות הדימות צריך להיבחר בקפידה בהתאם לדרישות ניסיוני. סרטים לטווח קצר, קצב גבוה לעומת יחס אות לרעש גבוה צריך להיות מאוזן, בעוד צריכת חשמל גבוהה יחסית לייזר יכול לשמש מבלי להזיק הגלמים מדי. עם זאת, סרטים לטווח ארוך, עוצמת הלייזר יש להישמר ברמה מתונה, הגלמים צריך לא לדימות באופן רציף אלא בנקודות מסוימות הזמן, לדוגמה, כל 20 דקות. כדי להבטיח כי המבנה של עניין לא זזה מתוך בתחום התצוגה, ייתכן צורך להתאים מחדש את מיקום z-המחסנית בין נקודות זמן. לידע שלנו, פתיחת התיק הגולמי כשלעצמה אינה משפיעה על תזמון התפתחותית. עם זאת, שלב מבוקרי טמפרטורה אמור לשמש לסרטים לטווח ארוך כדי להבטיח תזמון התפתחותי תקין. שמירה על שיקולים אלה בחשבון, סרטים מאוד אינפורמטיבי ניתן לרכוש.
פרוטוקול שהוצגו ניתן להמחיש לא רק מורפוגנזה גיד השריר, אלא גם רקמות מתפתחות אחרות, לדוגמה, האגף אפיתל29. רק שלושה שינויים בפרוטוקול זה נדרשים: (1) פתיחה של המקרה הגולמי מעל הכנף במקום בית החזה או בבטן, (2) מיקום של הגלמים עם האגף לכיוון של coverslip העליון ו- (3) שימוש שונה פלורסנט סמן חלבונים. עם ההתקדמות של CRISPR/Cas9-הטכנולוגיה, חלבונים פלורסנט מתויג יותר endogenously יהיו זמינים, כי זה הפך להיות יותר ישירה למטרה לוקוסים אנדוגני ב דרוזופילה30,31 , 32. בעתיד, זה יאפשר שחקרתי את הדינמיקה של מספר חלבונים, תאים ורקמות כולו בסביבה הפיזיולוגית שלהם בפירוט.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מנואלה Weitkunat על רכישת הסרט S3. אנחנו מודים Reinhard Fässler לתמיכה נדיבה. עבודה זו נתמכה על ידי EMBO יאנג החוקר התוכנית (יצירות), המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP/2007-2013) / 310939 גרנט ERC (יצירות), חברת מקס פלנק (S.B.L., יצירות), את המרכז הלאומי דה לה רשרש של (CNRS) (יצירות), יוזמה מצוינות AMIDEX באוניברסיטת אקס-מרסיי (יצירות), הודיעו LabEX (יצירות) ו- Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Materials
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
| fly food in bottles (or vials) | – | – | standard culture medium |
| paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
| microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
| double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
| petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
| paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
| forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
| forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
| plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | – | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
| coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
| glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
| adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).
- Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
- Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).
- Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124 (17), 3333-3341 (1997).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).
- Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).
- Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).
- Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).
- Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
- Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).
- Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).
- Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).
- Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).
- Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135 (4), 621-626 (2008).
- Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
- Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
- Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).
- Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).
- Classen, A. -. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4 (12), 2409-2418 (2014).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
