In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

Divers tissus peuvent être imagé in vivo dans le développement des mouches nymphes, ce qui les rend un système modèle idéal pour étudier la morphogenèse des organes adultes. Parmi ceux-ci sont les muscles de vol indirect, l’épithélium de thorax, y compris les cellules de tendon, l’épithélium de l’aile, muscles abdominaux et le coeur22,23,24,25,26 , 27. ici, nous nous concentrons sur l’imagerie Webcam live de la morphogénèse musculaires et tendineuses. Pour une description détaillée des muscles de vol indirect et morphogenèse des muscles abdominaux et des méthodes supplémentaires pour étudier la biologie du muscle chez la drosophile, nous renvoyons le lecteur à Weitkunat et Schnorrer 201422. Vivre d’imagerie des muscles de vol indirect Pour étudier le développement à long terme des muscles du vol indirect comprenant les muscles dorsolongitudinaux (DLMs) et les muscles dorsoventral (DVMs), globulaire moésine domaine de liaison de l’actine tag avec GFP (SAMU -GFP-Gma) a été exprimé dans tous les muscles en utilisant le facteur de renforceur de Myocyte 2 (Mef2)-GAL4 pilote (Figure 2 a-D, Film S1). Avant l’imagerie, une fenêtre dans la pupe a été ouverte au-dessus de la cage thoracique, comme sur la Figure 1F. Sur un microscope biphotonique, z-cheminées ont été acquis toutes les 20 min de 21 h à partir de ≈11 h après formation puparium (11 h CSA). Dans ce laps de temps, les DLMs (vert superpositions en Figure 2 a’-D’) tout d’abord ouvrir la pièce jointe aux cellules tendineux (Figure 2 a) et ensuite divisé alors que les attaches musculaires matures (Figure 2 b). Ensuite, les myotubes raccourcir (Figure 2) jusqu’à ce qu’ils atteignent enfin la scène compactée au maximum à 30 h CSA (Figure 2D). Pris ensemble, ce film met en lumière des bouleversements dans la morphologie du muscle qui se produisent à l’échelle de temps d’heures. Figure 2 : imagerie de la morphogénèse musculaires et tendineuses de vol indirect en direct. (A-D) Fois points d’un film de deux photons (film S1) à l’aide de Mef2-GAL4, SAMU- GFP-Gma comme marqueur pour l’actine dans les muscles de vol indirect consistant en les muscles dorsolongitudinaux (DLMs, surlignés en vert a “-D”) et les muscles dorsoventral ( DVMs, surlignés en bleu a “-D”). Barreaux de l’échelle est de 100 µm. (E-H) moments d’un film de deux photons (film S2) à l’aide de Duf-GAL4SAMU-CD8-GFP comme marqueur des muscles du vol indirect et l’épithélium du thorax dont les cellules du tendon. Panneaux E’-H’ afficher une incrustation avec un modèle du système tendon-muscle à chaque moment, mettant en évidence les extensions longues cellulaires formée par l’épithélium du tendon (magenta) en contact avec les muscles (vert). Barreaux de l’échelle est de 100 µm (estimée à partir des dimensions des structures de représentation). (J’ai-L) Fois les points d’un film confocal bicolore, tourne disque (film S3) mettant l’accent sur l’initiation de muscle-tendon accessoire. Les cellules de tendon sont étiquetés avec sr-GAL4SAMU-palm-mCherry (magenta) et le dorsolongitudinaux indirecte vol muscles avec Mhc -Tau-GFP (en vert). Barreaux de l’échelle est de 10 µm. le temps est indiqué comme hh : mm après formation puparium (APF). Notez que pas tous les films ont été acquis sur une étape de contrôle de la température, par conséquent, le calendrier du développement peut-être diverger. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Pour l’étude de morphogenèse tendon et le muscle en même temps, liée à la membrane GFP (SAMU -CD8-GFP) a été exprimé en Dumbfounded (Duf)-GAL4 comme chauffeur, qui s’exprime aussi bien dans les cellules des tendons et des muscles de vol indirect (Figure 2E -H, film S2). Une z-pile a été prise sur un microscope biphotonique toutes les 20 min à partir de 16 h CSA pour 20 h. Alors que les myotubes compact (overlay vert dans la Figure 2E’-H’), le tendon de cellules forme extensions longues cellulaire qui s’allongent avec le temps (magenta superposition dans Figure 2E’-H’). Pris ensemble, ce film met en lumière l’étroite interaction entre le tendon et le muscle cellules in vivo. Pour étudier l’interaction des muscle-tendon plus en détail, deux couleurs, fort grossissement imagerie a été réalisée. Nymphes avec chaîne lourde de myosine (Mhc)-Tau-GFP dans la DLMs et SAMU -palmitoylées-mCherry (SAMU -palm-mCherry), conduit par stripe (sr)-GAL4 dans les tendons ont été photographié toutes les 5 min à partir de 12 h CSA pendant 4,5 heures sur un disque de rotation microscope confocal (Figure 2I-L, film S3). A 12 h CSA, les myotubes migrent vers leurs cellules cibles de tendon tout en formant de longs filopodes à leur extrémité (Figure 2I). Par la suite, les muscle et le tendon tissus pavimenteuses (Figure 2J, K) pour former une fixation stable. Avec la maturation de la pièce jointe, moins filopodes forme et l’interface de tendon-muscle lisse (Figure 2 L). Ainsi, l’imagerie bicolore, fort grossissement peut être utilisé pour révéler la dynamique cellulaire en détail dans l’organisme vivant. Vivre la formation image des muscles abdominaux Pour l’imagerie direct des muscles abdominaux (Figure 3film S4), Mef2-GAL4> SAMU-CD8-GFP a été utilisé comme un marqueur et une fenêtre a été ouverte au-dessus de l’abdomen dans la pupe comme indiqué dans la Figure 1. Comme dans le film de muscles de vol indirect représenté dans la Figure 2 a-D, la formation et la croissance des muscles abdominaux peuvent être suivis au cours de nombreuses heures de développement (h 55 dans film S4). Pendant ce temps, les myoblastes fusionnent pour former de plus en plus les myotubes (Figure 3 a). Les conseils de myotubes migrent vers leurs cibles de tendon, et après avoir branché sur les cellules de tendon, sont forment les unités contractiles des muscles, les sarcomères, (Figure 3 b-D). Figure 3 : vivre l’imagerie de la morphogénèse des muscles abdominaux. (A-D) Fois les points d’un film (film S4) à l’aide de Mef2-GAL4SAMU-CD8-GFP comme marqueur pour suivre la morphogenèse des muscles abdominaux. Panneaux A’-E’ afficher les superpositions avec les modèles d’un ensemble de muscles abdominaux (vert) qui se forme en reprenant le stade pupal. Barreaux de l’échelle est de 100 µm. le temps est indiqué comme hh : mm CSA. Le film a été acquis à la température ambiante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Vivre d’imagerie des contractions des muscles Contrairement à la Figure 2 et Figure 3, Figure 4 montre la dynamique musculaire survenant à l’échelle de temps de secondes : l’enregistrement live de contractions musculaires. Nymphes exprimant βPS-intégrine-GFP sous contrôle endogène ont été photographiés avec une résolution temporelle de 0,65 s dans un seul plan z sur un microscope confocal (Film S5). Dans l’exemple illustré à la Figure 4, les sites de fixation de trois DVMs (Figure 4 a) ont été projetés pendant 10 min à partir de 42 h CSA. Pendant ce temps, contraction de cinq événements ont été observés (Figure 4 b-F), montrant que les sarcomères sont déjà assemblés assez bien pour soutenir les contractions coordonnées à ce point dans le temps dans le développement. Par conséquent, imagerie des contractions musculaires peut servir une lecture fonctionnelle pour sarcomerogenesis déjà pendant le développement musculaire vol indirect28, par opposition à par exemple essais en vol, qui ne peut être effectuée qu’après l’éclosion. Figure 4 : imagerie des contractions des muscles en direct. (A) tout d’abord-point dans le temps d’un film (film S5) montrant les contractions des muscles de vol indirect dorsoventral à 42 h CSA en utilisant βPS-intégrine-GFP comme marqueur. Dans le champ de vision est le muscle sites d’attachement de DVM II 2, DVM III 1 et DVM III 2. (B-F) La couleur des superpositions de cinq épreuves individuelles de secousse, chacun montrant le cadre avant la secousse (magenta) et la première image de l’événement de la secousse (vert). Notez que les fibres musculaires individuels se contracter indépendamment les uns des autres. Flèches mettent en évidence le mouvement de contractions. La résolution temporelle du film est de 0,65 s. barres d’échelle sont 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Imagerie des protéines étiquetées de manière endogène en direct Semblable à βPS-intégrine-GFP, une grande collection de protéines de fusion exprimés chez la drosophile sous contrôle endogène a été généré2,3,4. Ces lignes de mouche peuvent être utilisés pour étudier par exemple la localisation subcellulaire ou les profils d’expression des protéines d’intérêt. La collection est particulièrement utile si les anticorps spécifiques ne sont pas disponibles ou la dynamique des protéines doit être étudiés en vivo sans fixation. La figure 5 illustre trois exemples des protéines de fusion exprimée de façon endogène de la mouche TransgeneOme (fTRG) bibliothèque, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figure 5 a, B), Talin-GFP (Figure 5, D) et βTubulin60D-GFP ( Figure 5E, F). L’expression de ces protéines peut être étudiée dans tous les tissus qui les expriment naturellement. Ici, nous montrons l’épithélium du thorax (Figure 5 aC, E) et les muscles du vol indirect ou leurs sites de fixation (Figure 5 bD, F) comme exemples. Figure 5 : imagerie Live de façon endogène tag protéines. (A, B) Maximums de prises des pupes exprimant Hts-GFP de z-cheminées. (C, D) Maximums de prises des pupes exprimant Talin-GFP de z-cheminées. (E, F) Maximums de prises des pupes exprimant βTubulin60D-GFP de z-cheminées. Panneaux A, C E montrent l’épithélium du thorax à 18, 24 et 18 h CSA, respectivement et panneaux B, D et F montrent les muscles de vol indirect ou leurs sites de fixation à 30 h CSA. Barreaux de l’échelle est 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.