Incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination
Summary
Cette présente protocole une perle roman in vitro d’analyse que plus modèles convenablement le processus d’ in vivo la germination de l’angiogenèse en incorporant des péricytes. Cette modification permet le dosage de la perle à récapituler plus fidèlement les interactions cellulaires hétérotypiques entre cellules endothéliales et murales qui sont essentiels pour l’angiogenèse.
Abstract
L’angiogenèse est la croissance de nouveaux vaisseaux du système vasculaire préexistante et est un élément important de nombreux processus biologiques, y compris l’embryogenèse et développement, la cicatrisation, la croissance tumorale et les métastases et les maladies cardiovasculaires et oculaires. Modèles efficaces in vitro qui récapitulent la biologie de l’angiogenèse sont nécessaires pour bien étudier ce processus et identifier les mécanismes de régulation qui peuvent être ciblés en fin de compte, de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le dosage de l’angiogenèse perle a été démontré précédemment pour récapituler les étapes multiples de germination endothéliales in vitro. Toutefois, une limitation de ce test est un manque d’endothéliales – interactions cellule murale, qui sont essentiels à la régulation moléculaire et phénotypique des cellules endothéliales function in vivo. Le protocole donné ici présente une méthodologie pour l’intégration de cellules murales dans le dosage de l’angiogenèse perle et montre une association étroite des cellules endothéliales et péricytes au cours de la germination in vitro. Le protocole détaille également une méthodologie de silençage efficace des gènes de cible à l’aide de siARN dans les cellules endothéliales pour études mécanistes. Au total, ce protocole prévoit un test in vitro qui mieux modélise les types de cellules différents impliqués dans l’angiogenèse de germination et fournit une plate-forme plus physiologiquement pertinents pour l’évaluation thérapeutique et découverte de mécanismes de régulation de l’angiogenèse.
Introduction
L’angiogenèse est vital à l’embryogenèse approprié et la cicatrisation des plaies, et il joue aussi des rôles clés dans nombreuses maladies, incluant les cancer progression des maladies coronariennes et1 . 2 , 3 avoir une meilleure compréhension de comment l’angiogenèse se produit au cours du développement normal, et comment elle est réactivée dans des contextes pathologiques, est critique pour le développement du roman, thérapeutique efficace. Fidèle à vitro modèles qui récapitulent les étapes importantes et les types cellulaires impliqués dans l’angiogenèse in vivo sont nécessaires pour permettre aux chercheurs de mieux caractériser les mécanismes moléculaires conduisant l’angiogenèse et faire de nouvelles découvertes dans le règlement endothélial.
Nakatsu et Hughes ont optimisé un test de germination perle subit les nombreuses étapes connues de germination angiogenèse ont démontré que. 4 , 5 l’objectif de la méthode présentée ici est de s’appuyer sur le dosage optimisé par Nakatsu et Hughes en intégrant des perictyes à l’essai, afin que les rôles paracrine et juxtracrine des cellules murales dans les cellules endothéliales de germination peuvent être incorporés dans angiogenèse nouvelles études. Péricytes sont des cellules murales qui sont définies par leur rôle plus près de cellules qui maintiennent un contact physique avec des cellules endothéliales en raison de leur être incorporé dans les membranes basales vasculaires. 6 péricytes et les cellules endothéliales s’engagent dans la diaphonie complexe via les voies y compris Notch de signalisation signalisation, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ et bien d’autres. 7 , 8 modèles de souris déficientes dans ces voies de signalisation démontrent pericyte mauvaise couverture de développer un système vasculaire dans l’embryogenèse, conduisant à un remodelage vasculaire pauvre et système vasculaire dysfonctionnel. 7 en outre, le rôle des péricytes dans l’angiogenèse pathologique est importante mais souvent sous-estimée. Par exemple, une caractéristique unique du système vasculaire tumoral est que les navires sont plus immatures, qui fuit et dysfonctionnelle en raison de la couverture de mauvaise pericyte. 9 il a été suggéré que la présence ou l’absence des péricytes dramatiquement incidence sur le phénotype de la tumeur des vaisseaux sanguins et est un médiateur important de réponses aux anti-angiogéniques et thérapies antitumorales. 9 ainsi, y compris le rôle des péricytes dans des essais in vitro sont la clé pour saisir plus complètement les importants mécanismes de régulation endothéliale.
Bien qu’il existe de nombreux essais in vitro et ex vivo , actuellement utilisés pour étudier l’angiogenèse, il y a des lacunes à considérer dans chacun. Certains, comme la prolifération endothéliale et des essais de migration endothéliale, sont trop simplifiées et de se concentrer sur une seule fonction endothéliale en milieu isolé sur le plastique de culture de tissus. 10 autres épreuves se produisent en plus 3 Dimensions (3D) milieu, tels que le dosage de la formation du tube Matrigel,10 mais ces dosages sont encore trop simpliste et se concentrent davantage sur la capacité des cellules endothéliales à migrer et à former de novo vasculaire Ouvrages d’art, par opposition à la germination de vaisseaux préexistant. En outre, aucun de ces tests intègrent des types cellulaires murales. Il y a ex vivo modèles tels que l’essai d’aorte de bague qui incorporent des péricytes présents dans l’organe hôte, mais les manipulations génétiques de ces modèles sont beaucoup plus difficile en raison de la nécessité de générer des modèles de souris knock-out ou transgéniques de la voies d’intérêt. Le talon du test de germination est idéal car il modélise la germination endothéliale, prolifération, migration et formation même anastomose et lumen dans une matrice 3D. 4 le test permet fidèlement pour évaluation mécaniste des différentes étapes de la germination, tout en permettant la modification génétique directe des cellules endothéliales ou péricytes dans un milieu contrôlé plus nombreux. Les caillots de fibrine contenant les billes de germination peuvent être facilement fixés, colorés et imagés à différents stades de germination ; ces germes peuvent également être placés dans une chambre d’imagerie direct pour effectuer une imagerie en temps réel de la germination. La méthodologie présentée ici est idéale pour l’étude des mécanismes fondamentaux de l’angiogenèse par le biais de phénotypage de profondeur et une analyse approfondie des voies activées au cours de l’angiogenèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente une méthode permettant de caractériser les étapes complexes et des interactions cellulaires hétérotypiques de germination angiogenèse en permettant au chercheur d’employer des approches génétiques et d’imagerie, de mener des enquêtes approfondies mécanistes. Lorsque vous effectuez le test, il est essentiel qu’efficace revêtement endothélial des perles se déroule pendant le talon étapes d’agitation. Revêtement endothélial pauvres seront évidente, si les perles ne semblent pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs Victoria Bautch et Joshua Boucher de discussions utiles et des conseils sur l’optimisation standard perle germination conditions d’essais et un test de germination souillant le protocole. S.H.A. a été financée en partie par une subvention de la National Institute of General Medical Sciences sous prix 5T32 GM007092.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
