Integratie van Pericytes in een parel van de Endothelial cel kiemen Assay
Summary
Dit protocol presenteert een kraal roman in vitro assay dat meer modellen op de juiste wijze het proces van in vivo angiogenese kiemen door pericytes op te nemen. Deze wijziging maakt het mogelijk de bepaling van de kraal te recapituleren meer getrouw de heterotypic cellulaire interacties tussen endotheliale cellen en muurschildering cellen die essentieel zijn voor angiogenese.
Abstract
Angiogenese is de groei van nieuwe schepen uit reeds bestaande therapieën en is een belangrijk onderdeel van vele biologische processen, met inbegrip van de embryogenese en ontwikkeling, wondgenezing, tumorgroei en uitzaaiing, en oculaire en cardiovasculaire ziekten. Effectief in vitro modellen die de biologie van angiogenese recapituleren zijn nodig om op de juiste manier studeren dit proces en identificeren van mechanismen voor regelgeving die uiteindelijk kan worden gericht voor nieuwe therapeutische strategieën. De bepaling van de angiogenese kraal is eerder aangetoond de meerdere fasen van het endotheel kiemen recapituleren in vitro. Een beperking van deze bepaling is echter het ontbreken van endotheel-muurschildering cel interacties,, die zijn de sleutel tot de moleculaire en fenotypische verordening van endothelial cel functie in vivo. Het protocol hier gegeven presenteert een methodologie voor de opneming van de muurschildering cellen in de bepaling van de angiogenese kraal en toont een strakke vereniging van endotheliale cellen en pericytes tijdens de kiemen in vitro. Het protocol gegevens ook een methodologie voor effectieve silencing van doelgenen met behulp van siRNA in endotheliale cellen voor mechanistische studies. Over het geheel genomen voorziet dit protocol in een in vitro assay die doelmatiger modellen van de diverse celtypes die betrokken zijn bij het kiemen van de angiogenese, en biedt een fysiologisch-relevanter platform voor therapeutische beoordeling en nieuwe ontdekking van mechanismen van angiogenese verordening.
Introduction
Angiogenese is essentieel voor passende embryogenese en wondgenezing en het speelt ook spelen een belangrijke rol in talrijke ziekten waaronder kanker progressie1 en coronaire ziekte. 2 , 3 hebben een beter begrip van hoe angiogenese optreedt tijdens normale ontwikkeling, en hoe het wordt geactiveerd in de pathologische contexten, is cruciaal voor de ontwikkeling van de roman, effectieve therapeutics. Trouw in vitro modellen die de mijlpalen en celtypes die betrokken zijn bij de angiogenese in vivo recapituleren zijn nodig om onderzoekers beter karakteriseren de moleculaire mechanismen rijden angiogenese en nieuwe ontdekkingen in de verordening van het endotheel.
Nakatsu en Hughes hebben een gekiemde kraal-test die zij aangetoond de vele bekende stadia dat hebben van kiemen angiogenese ondergaat geoptimaliseerd. 4 , 5 het doel van de methode die hier gepresenteerd is voort te bouwen op de assay geoptimaliseerd door Nakatsu en Hughes door de integratie van perictyes in de assay, zodat de paracrine en juxtracrine functies van muurschildering cellen in endothelial cel kiemen kunnen worden opgenomen in Roman angiogenese studies. Pericytes zijn muurschildering cellen die zijn gedefinieerd door hun rol als cellen die handhaven sluiten fysiek contact met endotheliale cellen als gevolg van hun wordt ingebed in het vasculaire membraan van de kelder. 6 Pericytes en endotheliale cellen zich bezighouden met complexe kruis-talk via trajecten met inbegrip van Inkeping signalering signalering, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ en vele anderen. 7 , 8 Muismodellen tekort aan deze signaalroutes tonen arme pericyte dekking therapieën in embryogenese, wat leidt tot slechte vasculaire remodeling en disfunctionele therapieën te ontwikkelen. 7 bovendien de rol van pericytes in het pathologische angiogenese is belangrijk, maar vaak onder-gewaardeerd. Een uniek kenmerk van tumor therapieën is bijvoorbeeld dat de vaartuigen meer onrijpe, lekkende en disfunctionele als gevolg van slechte pericyte dekking zijn. 9 er is voorgesteld dat de aanwezigheid of afwezigheid van pericytes drastisch invloed op het fenotype van tumor-bloedvaten en een belangrijke bemiddelaar van reacties op antiangiogenic en antitumorale therapieën is. 9 zo, met inbegrip van de rol van pericytes in in vitro testen is sleutel tot de belangrijke mechanismen van endothelial verordening meer volledig te vangen.
Hoewel er veel in vitro en ex vivo tests momenteel werkzaam te bestuderen van de angiogenese, zijn er tekortkomingen in elk te overwegen. Sommige, zoals endotheel proliferatie en endotheel migratie vitrotests, zijn overdreven vereenvoudigd en concentreren op één endothelial functie in een geïsoleerde omgeving op weefselkweek plastic. 10 andere testen optreden in een meer 3 dimensionale (3D) omgeving, zoals de Matrigel bepaling voor de vorming van de buis,10 maar deze testen nog oppervlakkig zijn en zich meer richten op het vermogen van migreren en vormen van DOVO vasculaire endotheliale cellen structuren, in tegenstelling tot de kiemen van reeds bestaande therapieën. Bovendien nemen geen van deze tests muurschildering celtypes. Er zijn ex vivo modellen zoals de bepaling van de aorta ring die pericytes aanwezig in de host-orgel nemen, maar genetische manipulatie van deze modellen is veel moeilijker als gevolg van de noodzaak van het genereren van de afvalrace of transgene muismodellen van de trajecten van belang. De parel kiemen assay is ideaal omdat het endotheel kiemen, proliferatie, migratie en zelfs anastomose en lumen vorming in een 3D matrix modellen. 4 de assay getrouw voorziet mechanistische beoordeling van de vele verschillende stadia van het kiemen, terwijl nog steeds voor directe genetische modificatie van de endotheliale cellen of pericytes in een meer gecontroleerde omgeving. Het fibrine stolsels bevattende de gekiemde bolletjes kunnen worden gemakkelijk vast, gekleurd en beeld in verschillende stadia van kiemen; Deze kiemen kunnen ook worden geplaatst in een levende imaging kamer uit te voeren real-time beeldvorming van kiemen. De hier voorgestelde methodologie is ideaal voor het bestuderen van de basismechanismen van angiogenese via diepte fenotypering en grondige analyse van de trajecten geactiveerd tijdens angiogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor het karakteriseren van de complexe stadia en heterotypic cellulaire interacties van kiemen angiogenese doordat de onderzoeker om genetische en imaging benaderingen grondige mechanistisch onderzoek te verrichten in dienst. Als u de test uitvoert, is het essentieel dat efficiënte endothelial coating van de kralen tijdens de kraal agitatie stappen plaatsvindt. Arme endothelial coating zal duidelijk zijn, als de kralen niet lijken te hebben een ruw oppervlak van golf bal-achtige de volgen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Victoria Bautch en Joshua Boucher voor nuttige discussies en advies voor het optimaliseren van standaard kraal gekiemde assay voorwaarden en een gekiemde assay kleuring protocol. S.H.A. was deels gesteund door een subsidie van de National Institute of General Medical Sciences onder toekenning van 5T32 GM007092.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
