Метод для изучения полиморфизма C924T гена рецептора тромбоксана А2
Summary
В настоящем исследовании, мы описывают методологию для анализа генотипа C924T. Протокол состоит из трех фаз: экстракции ДНК, амплификации цепной реакции полимеразы (PCR), и анализ полиморфизма длины рестрикционных (фрагментов ПДРФ) на геле агарозы.
Abstract
Тромбоксана А2 гена рецептора (TBXA2R) является членом надсемейства G-белка в сочетании с семь трансмембранных регионами. Он участвует в прогрессии атерогенеза, ишемии и инфаркта миокарда. Здесь мы представляем методологии пациента генотипирования расследовать post-transcriptional роль полиморфизм C924T (rs4523), расположенный в регионе 3′ гена рецептора TBXA2. Этот метод полагается на экстракции ДНК из цельной крови, полимеразной цепной реакции (ПЦР) усиление часть гена TBXA2, содержащих C924T мутации и выявление дикого типа и мутантов генотипов с помощью анализа дайджест ограничение, Гель специально полиморфизма длины рестрикционных (фрагментов ПДРФ) на агарозе. Кроме того результаты были подтверждены секвенирование гена TBXA2R. Этот метод имеет несколько потенциальных преимуществ, таких как высокая эффективность и быстрой идентификации C924T полиморфизм PCR и энзима ограничения анализа. Этот подход позволяет интеллектуального исследования для зубного налета и прогрессирование атеросклероза, анализируя пациента генотипы для TBXA2R C924T полиморфизма. Применение этого метода имеет потенциал для выявления предметов, которые более восприимчивы к атеротромботических процессов, в частности темы в группе высокого риска, лечение аспирин.
Introduction
TBXA2R является членом надсемейства G-белка в сочетании с семь трансмембранных регионами, которые являются широко выразили и локализованы на мембраны клеток или на внутриклеточные структуры1,2. Сигнальный путь TBXA2R участвует в передовых атеросклеротических процессов3. Увеличение выражение рецептора TBXA2 была продемонстрирована во время атерогенеза прогрессии и клинические и экспериментальные исследования показали свою соответствующую роль в4ишемии и инфаркта миокарда. C924T, единичных нуклеотидных Однонуклеотидный полиморфизм гена TBXA2R, был признан в качестве функционального полиморфизм у здоровых добровольцев и был связан с5клинических расстройств. Кроме того наши предыдущие исследования6 показали, что C924T полиморфизм гена TBXA2R участвует в Стенограмма стабильности; в частности является увеличение нестабильности мутантный тип Стенограмма (TT) в отношении дикого типа (CC). Кроме того несколько раздражители, такие как аденозиндифосфат (ADP), адреналина и коллагена в различных концентрациях индуцированной агрегации тромбоцитов менее эффективен для мутантов типа (TT). Это согласуется с сокращением тромбообразованию и гемостаз. Таким образом нестабильность TBXA2R Стенограмма и связанных снижение агрегации тромбоцитов могут быть связаны с защитной роли генотипа TBXA2R TT против atherothrombosis и его осложнений у пациентов высокого риска аспирин лечение6 .
Здесь мы описываем методологии для пациента генотипирования расследовать post-transcriptional роль C924T полиморфизма (rs4523) расположен в регионе 3′ гена рецептора TBXA2. Этот метод опирается на следующие шаги: (1) ДНК извлечения из цельной крови, (2) ПЦР-амплификации части гена TBXA2R, содержащих C924T мутации и (3) определение дикого типа и мутантов генотипов, с помощью ограничения длины фрагмента Полиморфизм (RFLP) на геле агарозы. ПРФ-это техника, которая использует вариации в гомологичных последовательностей ДНК7. Это приложение было использовано для обнаружения ДНК полиморфизмы, особенно ОНП, найти и связать биологической значимости в генетических вариаций8. Полиморфизм, анализируются в первый раз, с помощью ПЦР-ПДРФ людьми был крови ABO9. Метод ПЦР-ПДРФ позволяет анализ генетических мутаций в гомологичных последовательностей ДНК, оценивая наличие фрагментов разной длины после переваривания ДНК, используя весьма специфические эндонуклеазами ограничения10.
В последние годы, были использованы следующие методологии для анализа SNP, с помощью метода PCR: гибридизации коротких Аллел Специфически олигонуклеотиды11, Аллел Специфически PCR12, выдвижение праймера на ДНК microarrays13, Перешнуровка олигонуклеотида пробирного14, прямой ДНК последовательности для выявления положение конкретных сингл нуклеотидных полиморфизмов15, Taqman метод16, добыча Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации время-из-рейс) MALDI-TOF)17масс-спектрометрии и GeneChips18. Эти методы не являются простыми в использовании и могут потребовать дорогостоящего оборудования. И наоборот метод ПЦР-ПДРФ недорогой, простой в использовании, удобный, обладает высокой эффективностью и позволяет быстро идентифицировать C924T полиморфизма. Кроме того мы подтвердили результаты, секвенирование гена TBXA2R, с помощью метода Сэнгер15.
Этот подход позволяет прогнозирования исследование зубного налета и прогрессирование атеросклероза, анализируя пациента генотипы для TBXA2R C924T полиморфизма. Этот метод может определить темы, более восприимчивы к атеротромботических процессов, в частности, среди пациентов высокого риска, лечение аспирин.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем исследовании мы описали методологии, которая позволяет пациенту генотипирования с целью расследования post-transcriptional роль C924T полиморфизма (rs4523) расположен в регионе 3′ TBXA2R гена. Во-первых этот метод полагается на экстракции ДНК из цельной крови. В частности это первый процесс состоит из очищения всего ДНК человека, геномных и митохондриальных, пробах цельной крови, свежие или замороженные, относились с ЭДТА (цитрат или гепарин). За короткий срок хранения образцов цельной крови храните при температуре 2-8 ° C до 10 дней. Для хранения более 10 дней, хранения образцов в 70 ° C. Процесса автоматизированной очистки состоит из 4 шагов: лизируют, привязать, вымыть и элюировать. Во-вторых метод полагается на амплификации PCR части гена TBXA2R, содержащих C924T мутации. Наконец выполняется идентификация дикого типа и/или мутант генотип с помощью энзима ограничения анализа (RFLP) на геле агарозы.
Важнейшие шаги в протоколе, являются следующие: (i) в том случае, если часть геля агарозы хранении в RT используется, затвердевших агарозы могут быть повторно растворенного над кипящей водяной бане (при 60 ° C для около 15-20 мин.) или в микроволновой печи (3-5 мин) до заливки. Примечание: ослабьте крышку, когда переплава агарозы в бутылке. (ii), Кроме того, при повторном нагревании агарозы, испарение приведет к увеличению его концентрации. По этой причине он может быть полезным для компенсации путем добавления небольшого количества воды. (iii) ДНК фрагментов менее чем 1000 буфере TBE рекомендуется получить лучшее возможное разделение и bp были дифференцированы на геле агарозы. (iv) мы предпочитаем использовать геля агарозы, вместо того, чтобы гель полиакриламида, потому что подготовка последнего является более сложным, и она занимает гораздо больше времени, чтобы настроить. (v) выбор времени электрофореза геля зависит от ожидаемого размера продуктов амплификации. На основе этого протокола, достаточно для выполнения электрофорез на 20-30 мин на 100 V в 2% агарозном геле, поскольку размер ПЦР фрагментов варьируется от 100-500 bp. (vi) он является обязательным для получения 10-50 ng шаблона хорошего качества ДНК, извлеченные из человеческих образцов . По этой причине мы предпочитаем использовать автоматизированной очистки ДНК, вместо того, чтобы полуавтоматических или ручной один. (vii) подготовить реакция Мастер микс для амплификации PCR и Мастер микс решение для ПЦР продукты пищеварения, добавляя 10% больше (для учета потери жидкости во время дозирование) к объему рассчитываются умножается на число образцов для необходимого объема на 1 образец ДНК.
Наиболее часто ловушка метода является наличие дополнительного усиления продуктов из-за неправильного тепловая велосипедист программы, неправильный усиление подготовки Мастер микс или ДНК шаблоном засоренности. Кроме того отсутствие продуктов ПЦР может объясняться инактивированных полимеразы Taq или неправильный тепловой циклователь запуска. Кроме того наличие неожиданных фрагментов может быть из-за загрязнения продукта ПЦР или неполное переваривание из инактивированных фермента, слишком мало количество энзима ограничения объема или слишком короткий инкубационный период.
В последние годы, были использованы следующие методологии для анализа SNP, с помощью метода PCR: гибридизации коротких Аллел Специфически олигонуклеотиды11, Аллел Специфически PCR12, выдвижение праймера на microarrays ДНАА13 , лигирование олигонуклеотида проба14, прямого секвенирования ДНК для идентификации позицию конкретного сингл нуклеотидных полиморфизмов15, Taqman метод16, добыча Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации Время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии17и GeneChips18. Эти методы не являются идеальными, поскольку они являются не просто использовать и/или требуют дорогостоящего оборудования. И наоборот ПЦР-ПДРФ метода, описанного в настоящем исследовании недорогой, простой в использовании, удобный, обладает высокой эффективностью и позволяет быстро идентифицировать C924T полиморфизма. Ограничение до нынешнего метода является, что он может использоваться только для небольшого числа полиморфизмов и несколько образцов в сеансе работы.
Для будущих применений этот метод может использоваться для прогнозирования исследований, касающихся зубного налета и прогрессирование атеросклероза, анализируя пациента генотипы для TBXA2R C924T полиморфизма. Кроме того этот метод может определить темы, более восприимчивы к атеротромботических процессов, в частности, высокого риска пациентов с аспирином. Наконец, этот метод может применяться для изучения других полиморфизмы, участвующих в персонализированной медицины для конкретных наркотиков (например, антикоагулянтов и противосудорожные средства) для того чтобы понять соответствующие препарата дозировку и индивидуальные фармакологических и клинические ответ для каждого пациента перед началом терапии и чтобы избежать негативных последствий.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект частично финансируется 60% Ateneo гранты от Министерство dell’Università, Италия с.м. и Е.Т. Мы также получили частичный вклад в исследования расходов департамента медицинских, Оральный и биотехнологических наук университета Кьети «G. d’Annunzio».
Materials
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |
References
- Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
- Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
- Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
- Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
- Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
- De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
- Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
- Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
- Lee, J. C. -. I., Chang, J. -. G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
- Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
- Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
- Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
- O’Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).
- Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).
- Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
- Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5′ nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
- Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).
