CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

薬の Baylor の大学倫理委員会のガイドラインをプロトコルに従います。マウスで実行されるすべての実験手順は、ベイラー大学の医学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されます。 1. sgRNA Fwd デザイン Http://www.crisprscan.org/?page=track8興味の sgRNAs の設計を開始するに移動します。 「マウス」または興味の細胞の種類に応じて「人間」のボタンをクリックします。 UCSC の検索ボックスに興味の遺伝子を入力し、移動を押します。 ズームインし、遺伝子の領域への移動 (すなわち。 特定のエクソン) ターゲットに関心が。注:ターゲットはお勧め効率的な遺伝子破壊を達成するために最も早い exon(s) はあなたの特定のセルの型すべて転写アイソ フォームに存在します。 「遺伝子 (CD) に CRISPRscan の予測」の下で潜在的な sgRNA ターゲット シーケンスが表示されていることを確認見出し。 比較的高いスコアを持つターゲット シーケンスを検索してクリックとオフ ターゲットのいくつか (明るい緑色で強調表示されます)。「オリゴ シーケンス」セクションの下に表示、完全なシーケンスをコピーしてテキスト文書に貼り付けます。シーケンスの 3′ 末端に”ATAGC”を追加します。完了すると、フルの長さのシーケンスの順序を配置します。注:各ターゲット シーケンスの CRISPRscan8は T7 プロモーター、protospacer (ターゲット) のシーケンス、および普遍的な足場の重複のシーケンスが含まれています「統合」前方 sgRNA プライマーを提供します (図 1A参照)。フルレングスのシーケンスは、56 か 57 のヌクレオチドの protospacer の長さに応じて作られています。 2. sgRNA DNA 鋳型合成 溶解し、希釈 sgRNA Fwd と Rev の普遍的なプライマー (完全なシーケンスの表 1 を参照)。10 μ M の最終濃度を得るために 100 μ M にプライマーを希釈し、1:10 を作る方法についてメーカー指示に従ってヌクレアーゼ フリー水で希釈します。 PCR をオーバー ラップを実行する (図 1B参照)、ミックス PCR ストリップ管次: 2 μ L 前方 sgRNA プライマー (10 μ M)、2 μ L 回転足場の普遍的なプライマー (HPLC 精製) (10 μ M)、10 μ L 高忠実度 DNA ポリメラーゼ マスター ミックス (2 倍)、6 μ L ヌクレアーゼ フリー水。 次のプログラムで PCR を実行: 95 ° C、3 分、98 ° C、5 s、60 ° C、5 s 72 ° C、10 s、2 に 6 サイクル、72 ° C 1 分、永遠の 4 ° C のために行く。 DNA 精製カラム (材料の表を参照してください) を使用して PCR の製品を浄化します。メーカーの指示に従い、11.5 μ L の溶出バッファーで溶出します。 分光光度計に PCR の製品の濃度を測定します。空白の溶出バッファーを持つ楽器。注:DNA 濃度は、50 〜 と 〜 120 ng/μ L の間する必要があります。 3. sgRNA のin Vitro転写 (試薬は RNA 合成キットで提供されます) PCR ストリップ管の次のコンポーネントをミックス: 溶離された DNA や dNTPs の 4 μ、1 μ L 反応バッファー x 10 の T7 RNA ポリメラーゼ酵素ミックスの 1 μ L の 4 μ L。 少なくとも 4 時間のための 37 ° C でサンプルをインキュベートします。 手袋をはめた手から RNase を削除する RNase 洗浄剤を適用します。 ヌクレアーゼ フリー水で 50 μ L の総ボリュームまで各 RNA サンプルを持参 (製造元の指示に従っての RNA の浄化の第一歩)。 製造元の指示に従っての RNA の浄化と進み、キット提供のヌクレアーゼ フリー水の 50 μ L の溶出します。 分光光度計で溶離された sgRNA の濃度を測定します。ヌクレアーゼ フリー水と楽器がブランクです。注:浄化後利回りは、RNA (すなわち 1.0 1.5 μ g/μ L の濃度) の 50-80 μ g です。 すぐに浄化された sgRNA を使用または-80 ° c 2 4 μ L の因数で長期的に保存します。 4. HSPC の分離と培養 マウスの HSPCs の分離と培養注:男性と女性の Ubc GFP マウス (JAX004353) および Rosa26-LSL-tdTomato (JAX007914) 2-6 ヶ月歳の Vav 本院 (JAX008610) と交配は、以下に示す結果を得るため使用されました。 頚部転位による麻酔下マウスを安楽死させます。注:2 つの訓練を受けた人が独立して確認成功安楽死呼吸の不足に注意して、少なくとも 5 分のハートビートは動物から皮膚を削除します。 脛骨、大腿骨、およびマウスの腸骨稜を解剖し、すべての筋肉や解剖の骨の周りの結合組織を削除します。HBSS 2% を添加した氷の上の組織培養皿にそのまま骨を配置 FBS (HBSS +)。アル骨は洗浄され、細胞培養用ディッシュに転送としてすぐに層流フードに移動します。 転送洗浄は滅菌モルタル、含む 2 mL に骨冷えた HBSS + 3 骨あたり。乳棒を使用して、骨片、内から骨髄を解放に骨をつぶします。Pestling 骨が杵の下で割れを止めるまで続けます。 40 μ m の細胞ストレーナーを使用して 50 mL の円錐管にモルタルとフィルターから上澄みを収集します。5 mL の残りの骨片をリンス冷たい HBSS + と同じ 40 μ m ストレーナを使用して同じ 50 mL の円錐管にフィルターします。 締めくくりは冷たい HBSS + チューブおよび 7 分破棄上清 400 × g で遠心分離によって 2 回細胞を洗ってください。 次の 2 番目の洗浄は、20 mL の氷冷 PBS で細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー排除9によって実行可能なセルを数えます。 1 mL あたり 1 x 10 の8実行可能なセルを孵化させなさい冷たい HBSS + 氷の上の 45 分の 1: 100 希釈で c キット抗体をビオチン化します。 7 分間 400 × g で遠心分離し、上清を廃棄冷たい HBSS + 細胞を洗います。 製造元の指示に従って反ビオチン マグネティック ビーズを用いて細胞を孵化させなさい。 磁気列または製造元の指示に従って磁気活性化細胞選別機を使用して c キット陽性細胞を分離します。15 mL の円錐管に c キット陽性細胞を収集します。 15 mL の円錐管オフにトッピングで PBS で 2 回細胞を洗浄し、上澄みを廃棄 7 分 400 × g で遠心分離します。2 つの洗浄の間には、トリパン ブルー色素排除9実行可能なセルの合計数を計算します。 C を再停止しなさい-キット + 2 s、50 ng/mL マウス幹細胞因子 (SCF)、50 ng/mL マウス トロンボポエチン (TPO)、10 ng/mL マウスと IL-3、10 ng/mL マウス IL 6 補足マウス HSPCs の培養液 100 μ L につき最大 10 の6 viablecells の濃度で細胞。 37 ° c、5% CO2エレクトロポレーションの前に 24 時間の最大値を少なくとも 1 時間のセルを孵化させなさい。 人間の HSPCs の分離と培養注:層流フードには、これらの手順を実行する必要があります。 40 μ m 携帯こし器を通って骨髄・臍帯血の細胞をフィルターします。 1:2 フィルター選択された骨髄・臍帯血の細胞を 1 mM EDTA (PBS/EDTA) を添加した PBS で希釈します。 密度勾配媒体の 15 mL を 50 mL の円錐管に分配します。優しく密度勾配培地表面に希釈した骨髄・臍帯血の 30 mL を注ぐ。細胞懸濁液の量が 30 mL より大きい場合は複数のチューブを用意します。注:血と密度勾配媒体間のインターフェイスをできるだけシャープに維持することを確認します。 スローダウンしないと 30 分 750 x g でチューブをスピンします。 きれいな 50 mL の円錐管に媒体のインターフェイスで転送検出単核細胞層を収集します。PBS/EDTA 管を埋めるし、280 g で 15 分間破棄で細胞の上清をスピンします。 上清を廃棄、PBS/EDTA スピン 7 分 400 x g での 2 回セルを洗浄します。 製造元の指示に従って抗 CD34 磁気ビーズの単核細胞を孵化させなさい。 CD34 陽性細胞磁気列または製造元の指示に従って磁気活性化細胞選別機を使用して分離します。15 mL の円錐管に CD34 陽性細胞を収集します。 洗浄は、2 回での締めくくりは PBS でチューブとは 7 分間 400 x g で回転し、上清を廃棄 CD34 陽性細胞を収集しました。2 つの洗浄の間には、トリパン ブルー色素排除9実行可能なセルの合計数を計算します。 100 ng/mL 添加培養液中の細胞を再懸濁します人間 SCF、100 ng/mL 人間 FLT3 リガンド (FLT3L) 100 ng/mL ~2.5 x 105の生菌数濃度で人間の TPO/ml. 文化 37 ° C、最大 48 時間前に 24 h の 5 %co2 で CD34 陽性細胞を分離しました。エレクトロポレーション。注:エレクトロポレーションの前にフローサイトメトリーによる CD34 陽性人口濃縮の純度を確認してください。 5. エレクトロポレーション 注:次のプロトコルは、10 μ L の電気穿孔法のヒントに最適です。層流フードのすべての手順を行わなければなりません。 トリパン ブルー色素排除9セルをカウントします。(例: 6 x 105セル 3 electroporations のために収集) あたり 2 × 105生菌を収集します。 7 分慎重に 300 x g で回転、PBS で 2 回洗って細胞上清を削除します。 並行して、PCR チューブ Cas9 唯一のコントロールを除く、各複製の合計 sgRNA の 1 μ g で RT 1.5 μ g Cas9 で 20-30 分のための孵化によって Cas9 sgRNA RNP 複合体を準備します。注:Cas9 タンパク質は、10 μ g/μ l の濃度で提供しています。確実に正確な分注、希釈 1:10 ヌクレアーゼ フリー水で必要な Cas9 タンパク質の総量 (10 electroporations のための例えば Cas9 蛋白質の 1 μ l を取るとヌクレアーゼ フリー水の 9 μ l で希釈し、1 μ l あたりの希薄化後の Cas9 を孵化させなさい。SgRNA の濃度に応じてあたり 1.7 と 2 μ l の間 Cas9 と sgRNA の合計量を構成する必要があります。2 つを使用している場合 sgRNAs インキュベート 500 あたりの各 sgRNA の ng3 を使用している場合 sgRNAs インキュベート 330 複製、1 各 sgRNA の ng。 合計数 10 μ L を乗じて必要バッファー T 複製再懸濁量必要 (例えば 3 複製の 30 μ L) を計算します。バッファー t. は、細胞懸濁液の最終濃度が 2 x 107セル/mL であることを確認の計算された容積を小球形にされた細胞を再懸濁します。 分注 10 μ L、pre 複合 sgRNA/Cas9 RNP (例えば中古複合 Cas9 sgRNA を含む PCR チューブに細胞懸濁液の 3 通因数 30 μ L) を含む各 PCR チューブに再懸濁細胞/複製。 設定するには、エレクトロポレーション システムは楽器をオンに、エレクトロポレーション キュベット、E バッファーの 3 mL を加えるし、キュヴェットをキュベット ホルダーに差し込みます。 デバイスに必要なエレクトロポレーション条件を設定: 人間 HSPCs (1600 V、10 ms、3 パルス) またはマウス HSPCs (1700 V、20 ms、1 パルス)。注:CD34 陽性 HSPCs の実験を実行する前に、希望と sgRNA 効率が急性骨髄性白血病 (AML) 細胞 (例えば HL60) 次のエレクトロポレーション条件で同じ戦略 (急性骨髄性白血病細胞株中無料の抗生物質使用) を使用でテストします。R、1350 V、35 ミリ秒、1 パルスをバッファーします。 エレクトロポレーションのピペット チップにラッチ爪を持っている特別なエレクトロポレーション ピペット、エレクトロポレーション、実行されます。エレクトロポレーションのピペットなどを保持、爪を拡張、ピペット チップの中にディスクをつかむし、しっかりと押しますボードコネクター ピペット先端。 ピペットのミックスに 10 回上下サンプル。泡がないことを確かめて、10 μ L を取り出して、エレクトロポレーション キュベットに電解のバッファーに直接ピペット チップを挿入します。キュヴェットの壁に触れないようにしてください。画面の「スタート」を押します。「完了」のメッセージが表示されたら、ピペットを削除し、新しい HSPC 培とに内容を分配します。 すべてのサンプルに対して繰り返します。必要な場合のみ変更ピペットの間サンプル、ヒントします。