تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9
Summary
بروتوكول لسريع كريسبر/Cas9-بوساطة تعطيل الجينات في الماوس والخلايا المكونة للدم الابتدائي البشرية الموصوفة في هذا المقال. وقدم ريبونوكليوبروتينس Cas9-سجرنا عبر انهانسر مع سجرناس التي تم إنشاؤها عن طريق النسخ في المختبر و Cas9 التجارية. وتتحقق الكفاءة العالية التحرير مع ضيق الوقت والتكلفة المالية.
Abstract
التقدم المحرز في مجال الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ساعدت بأساليب مهندس وراثيا الخلايا السلف الأولية، فضلا عن نماذج حيوانية. الاستئصال الكامل الجينات في هسكس المطلوبة توليد الفئران خروج المغلوب التي هسكس يمكن أن تكون معزولة، والاجتثاث الجينات في هسكس البشرية الأولية لم يكن ممكناً. يمكن توصيل الفيروسية للنهج تدق لأسفل، ولكن هذه تعاني من نجاعة متغير. في التلاعب بوجه عام، الوراثية البشرية والخلايا المكونة للدم الماوس أعيق منخفضة الكفاءة والوقت واسعة النطاق والتكلفة من الالتزامات. في الآونة الأخيرة، اتسع كريسبر/Cas9 هائلة القدرة على هندسة الحمض النووي لخلايا الثدييات. ومع ذلك، تطبيق كريسبر/Cas9 للخلايا المكونة للدم قد تم تحدي، أساسا بسبب ما تعداء منخفضة الكفاءة، سمية النهج المستندة إلى بلازميد والزمنية بطيئة للبروتوكولات القائمة على الفيروس.
طريقة سريعة لأداء الجين كريسبر/Cas9-بوساطة التحرير في مورين والبشرية الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا ذات الكفاءة بالضربة القاضية لتصل إلى 90% يتم توفيرها في هذه المقالة. ويستخدم هذا النهج استراتيجية تسليم ribonucleoprotein (رنب) مع تبسيط عمل ثلاثة أيام. يسمح استخدام رنب Cas9-سجرنا لاتباع نهج الكر وفر، إدخال أية تسلسلات الحمض النووي خارجية في جينوم الخلايا المحررة والحد من آثار خارج الهدف. الأسلوب القائم على رنب سريعة وواضحة: أنها لا تتطلب الاستنساخ سجرناس، إعداد الفيروسات أو تعديل المواد الكيميائية سجرنا محددة. مع أحكام هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون العلماء قادرة على توليد الضربة القاضية للجينات للفائدة في الخلايا المكونة للدم الابتدائي بنجاح في غضون أسبوع، بما في ذلك الأعطال لتوليف اليغنوكليوتيد. هذا النهج سوف تسمح لمجموعة أوسع من المستخدمين التكيف مع هذا البروتوكول لتلبية احتياجاتهم.
Introduction
ظهور كريسبر/Cas9 جذريا مبسطة تحرير الجينات في خلايا الثدييات. أوائل كريسبر/Cas9 البروتوكولات المستخدمة بلازميد أو التسليم على أساس الفيروس Cas9 البروتين وسجرنا1،،من23. أثبتت الثورية لوضع نماذج الخلوي والحيوان لهذه النهج وقد طبقت بنجاح أيضا على الأولية المكونة للدم الجذعية والسلف الخلايا (هسبكس)4،5. ومع ذلك، هذه الأساليب لديها عدد من العيوب. أولاً، الكفاءة تعطيل الجينات لا يزال غالباً ما دون 50%4،5. لئن كانت هذه كافية لتوليد الحيوانات المستنسخة (كو) بالضربة القاضية في خطوط الخلايا، الضرورة للثقافة قصير الأجل يجعل هسبكس غير قابلة لمثل هذه استراتيجية. ثانيا، الحاجة إلى الاستنساخ لأغراض تحديد كمية سجرناس التي يمكن اختبارها في تجارب واحد ويولد كبيرة، من الصعب على ترانسفيكت بنيات. ثالثا، هذه النهج قوة العلماء بطء مهل.
وللتغلب على هذه القيود، وضعت مجموعتنا ونشرت مؤخرا نهج بديل كريسبر/Cas9 في هسبكس ريبونوكليوبروتينس Cas9-سجرنا (رنبس) باستخدام–على أساس التسليم6. في هذه الاستراتيجية، مكونات الخام كريسبر (البروتين Cas9 و في المختبر نسخها سجرنا) قبل الرصاصية وتسليمها مباشرة إلى الخلايا المستهدفة عن طريق انهانسر (الشكل 1). فترة نصف العمر لمجمع رنب سجرنا Cas9 أقصر من الوقت يتم نسخها من ذلك بلازميد أو الحمض النووي الفيروسي، أقل مقارنة بمعدل خارج الهدف المبكر النهج7. وعلاوة على ذلك، تضيف النهج رنب الاستفادة من القضاء على أي مصدر للحمض النووي خارجية، والتي يمكن أن تدمج عشوائياً في جينوم الخلية المستهدفة مما يؤدي إلى تحويل الهاتف الخلوي.
ويستند هذا البروتوكول سير عمل مبسطة لإجراء التجارب على تعطيل الجينات على أساس رنب، كما هو ممثل في الشكل 1. الخطوة الأولى هي تصميم وترتيب الإشعال لكل سجرنا. وتستخدم هذه كبسولة تفجير جعل سجرنا الحمض النووي القوالب التي يتم استخدامها للنسخ في المختبر (IVT) للحصول سجرناس. ثم هي المحتضنة سجرناس المنقي مع البروتين Cas9 التي تم شراؤها سابقا، إلى نموذج Cas9-سجرنا رنب المجمعات. وأخيراً، هي قبل الرصاصية Cas9-سجرنا رنبس اليكتروبوراتيد في الخلايا. بعد انهانسر، يمكن اختبار تحرير الكفاءة و في المختبر/يمكن أن تبدأ التجاربفي فيفو ، تبعاً للاحتياجات. يمكن الاطلاع أدناه وصفاً مفصلاً لهذا النهج التجريبي المبتكر.
Protocol
Representative Results
Discussion
رنب النهج المبينة في هذا البروتوكول مفصلاً يتيح خروج المغلوب الجينات الفعالة في الماوس والأولية المكونة للدم الخلايا البشرية، وكذلك كما هو الحال في خطوط الخلايا تعليق. على الرغم من أن كثيرا ما يتم الحصول على كفاءات عالية جداً في كو، تحتاج إلى العديد من المتغيرات الحاسمة التي سينظر فيها. أولاً، اختيار إكسون السليم مفتاح ضمان أن إدراج كفاءة إينديل يتوافق مع خروج المغلوب الجينات. اثنين من العوامل الهامة التي تتعلق باختيار إكسون هي الحفظ عبر موقف isoforms واكسون داخل النصوص. أنماط التعبير Isoform متغير عبر أنواع الخلايا، حتى إذا كان المطلوب هو جين كو عبر أنواع الخلايا، خلية exons التي ثابتة بين أنواع ينبغي أن تستهدف. يمكن التحقق من Isoform أنماط استخدام q-PCR أو بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. لموقف إكسون داخل النصوص، فمن الأفضل لاستهداف exons المبكر الطفرات فراميشيفت في المحطة الطرفية أو إكسون قبل الأخير قد هربا من الاضمحلال بوساطة هراء10، إنتاج البروتينات مع الرواية أو وظائف غير معروف بدلاً من القيم الخالية الحقيقية.
تحديد إينديل تردد خطوة حاسمة لتقدير كفاءة كو وتفسير نتائج التجربة البيولوجية بشكل صحيح. فحوصات اندونوكليسيس (مثل المقايسة مساح) قد تتميز بأنها سريعة وسهلة لتنفيذ نسبيا. ومع ذلك، فإنها تميل إلى أن تكون غير دقيقة بسبب إشارات خلفية كبيرة والنتائج غالباً ما تكون صعبة استخراج. وعلاوة على ذلك، لا توفر معلومات عن نوعية إينديلس التي تم إنشاؤها (مثل طول عمليات الإدراج وعمليات الحذف) في التجربة. سانغر التسلسل يوفر بديلاً قيماً لفحوصات اندونوكليسي. منصات مثل المد11 (https://tide.nki.nl/) يساعد على تحلل آثار سانغر ووضع تقديرات دقيقة لانقطاع الاليلي الكفاءة، مع توفير الترددات إينديلس الفردية. العيب الرئيسي باعتماد مطلق على آثار التسلسل سانجر عالية الجودة. تسلسل أمبليكون الفائق ويتغلب على معظم هذه المسائل. يمكن إعداد مكتبات Amplicon بدءاً من مدخلات الحمض النووي منخفضة جداً ويضمن تغطية عالية نتائج يمكن الاعتماد عليها. لتقليل تكلفة التسلسل أمبليكون، أننا سبايك عادة في المكتبات amplicon إلى أكبر تسلسل تشغيل (مثل تسلسل الحمض النووي الريبي) باستخدام 1-1.5 في المائة فقط من مجموع ما يلي. أخيرا، لتأكيد نجاح بالضربة القاضية، ونحن بشدة توصي بتقييم مستويات البروتين بالبقع الغربية أو التدفق الخلوي، عندما يكون ذلك ممكناً.
كما هو موضح سابقا، الطريقة المعروضة هنا بشكل سريع ومباشر، ويمثل أداة جديدة لدراسة الجينات ضرب في هسبكس البشرية والماوس. بينما لدينا بروتوكول يوفر إرشادات للجينات بالضربة القاضية مع نظام القائم على نصيحة انهانسر، أثبتت أنظمة أخرى لتكون فعالة للغاية12،13.
القيود الرئيسية هما بحاجة إلى الاعتراف بها فيما يتعلق بنهج رنب. أولاً، كما هو موضح من مجموعتنا، صلاحية اليكتروبوراتيد هسبكس في المختبر نسخها سجرناس يمكن إلى حد كبير تتأثر انهانسر، وبخاصة عندما لا تكون الظروف المثلى6. إذا لزم الأمر، سجرناس المركب تجارياً (أي إزالة في المختبر النسخ) يمكن التغلب على هذه المشكلة. وهذه أصبحت أقل تكلفة مع الوقت ويمكن شراؤها من عدة بائعين. في هذا السيناريو، النسخ في المختبر يمكن أن تستخدم لتوليد مجموعة سجرنا إلى الشاشة لفعالية، ومن ثم يمكن تحديد sgRNA(s) الأكثر كفاءة لتوليف. والقيد الرئيسي الثاني النهج رنب هو عدم القدرة على تتبع الخلايا ترانسفيكتيد بنجاح، كما هو الحال في النهج المستندة إلى الفيروسية. ومع ذلك، عالية الكفاءة كو والتحرير السريع التي تم الحصول عليها مع رنبس سجرنا Cas9 قد تفوق هذه العيوب في العديد من السيناريوهات التجريبية. نوصي باستخدام تسلسل amplicon الفائق بالضبط تحديد كفاءة تعطل في كل تجربة. إذا كان المغلوب الجينات للفائدة من المتوقع أن يضفي النمط الظاهري التكاثري (أي تخفيض أو زيادة الانتشار مقارنة مع الخلايا البرية من نوع)، تحديد تواتر إينديل في نقاط زمنية متعددة يسمح أحد لتقييم ما إذا كان كو الخلايا الخضوع للتخصيب (أي إينديل التردد يزداد مع مرور الوقت)، أو هي تتغلب (أي. إينديل التردد يتناقص مع مرور الوقت).
يتطلب تنفيذ التجارب المجراة في أو في المختبر فهم الآثار البيولوجية لفقدان وظيفة الجينات عناصر التحكم المناسبة. وكما ذكر سابقا، في المختبر نسخها سجرناس قد تكون سامة للخلايا، وخلايا السلف لا سيما الابتدائي6. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسبب الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل الناجمة عن البروتين Cas9 الجينات استجابة مكافحة التكاثري المستقلة14. ولذلك، استخدم عدد من سجرناس التحكم في تجارب كريسبر غالباً ونوصي علامة خلية سطحية أعرب على نوع الخلية الخاصة بك، فضلا عن جينات هدف ثاني الذي أعرب عن عدم.
يزيد من كفاءة تعطيل الجينات6 الثقافة قصير الأجل من هسبكس البشرية حضور السيتوكينات وضروري لتحقيق الكفاءة العالية كو. لقد وجدنا 36-48 ساعة لتكون فترة مثالية للثقافة قبل انهانسر6. وبعد انهانسر، يمكن أن تكون الخلايا كذلك مثقف مع الأخذ في الاعتبار أن يعد ثقافة أعلى من خطر فقدان القدرة انجرافتمينت مولتيلينيجي. ولذلك، عادة ما نقوم بزرع 6 ساعات بعد انهانسر ولم يتجاوز 24 ساعة بعد انهانسر.
كريسبر/Cas9 تحسنا هائلا قدرة العلماء على نجاح تحرير جينوم خلايا الثدييات. جعل اضطراب الجينات أكثر جدوى في الخلايا الأولية المكونة للدم السلف من المتوقع أن سرعة تعزيز المعرفة العلمية في ميدان هسبكس والأمراض الدموية. الأهم من ذلك، البروتوكول الموصوفة هنا يجعل أيضا إمكانية توليد الضربة القاضية متعددة في وقت واحد بكفاءة عالية، مما يسمح للنمذجة للمناظر الطبيعية الوراثية معقدة، وكثيراً ما ينظر في الأمراض ليوكيميك.
على الرغم من أن البروتوكولات المبينة في هذا التقرير تركز على تعطيل الجينات، يمكن تكييفها بسهولة للجينات تدق في التجارب. وهذا يمكن إنجازه من خلال تقديم المشارك قوالب اليغنوكليوتيد واحد-الذين تقطعت بهم السبل لإصلاح موجه التماثل6،13 (HDR) أو عن طريق توصيل من الخلايا وظيفة-انهانسر مع ناقلات AAV6 التي تحتوي على قالب التماثل12. سيتم تيسير القدرة على إصلاح أو إدخال طفرات معينة في هسبكس استراتيجيات علاجية جديدة للعلاج الجيني والدراسة الموسعة للسرطان سائق الطفرات في مكافحة غسل الأموال وغيرها من الأمراض الدموية. وبينما تقرير التنمية البشرية في هسبكس البشرية نجاحا6،،من1213، الماوس هسبكس كان من الصعب على تحرير باستخدام هذه الاستراتيجية6. الأمثل للبروتوكولات تقرير التنمية البشرية في الإنسان، ولا سيما في هسبكس الماوس وسيمكن التحرير أكثر تحديداً واستحداث أدوات لتعقب الخلايا تم تحريرها باستخدام العلامات الذاتية.
وأخيراً، ومن المتصور أيضا أن تعطل متحولة مكسب للدالة الآليلات يمكن أن تمثل نهجاً علاجية محتملة للاضطرابات الخلقية والمكتسبة المكونة للدم. في هذا السيناريو، ينصح باتباع نهج خالية من الحمض النووي تفاديا التكاملات الممكنة التي يمكن أن تعزز التحول. وعلاوة على ذلك، أن النهج “اضرب واهرب” يقلل من احتمال آثار خارج الهدف غير مرغوب فيها. هناك حاجة إلى بذل مزيد من الجهود من أجل وضع نظم محددة للتسليم سوف يفتح آفاقاً جديدة لعلاج الأمراض الدموية الخبيثة وغير الخبيثة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل “الوقاية من السرطان”، ومعهد بحوث من تكساس (RP160283 و RP140001 و R1201)، مؤسسة الملاك غبريال “أبحاث السرطان” و “مؤسسة إدوارد ب. إيفانز”، والمعاهد الوطنية للصحة (DK092883، CA183252، CA125123، P50CA126752، CA193235، و DK107413). M.C.G. معتمد من قبل “دعاة بايلور البحوث” “العلماء الطالب”. التدفق الخلوي كان تدعمها جزئيا في المعاهد الوطنية للصحة (المركز الوطني “بحوث موارد” المنح S10RR024574، المعهد الوطني للحساسية و AI036211 من الأمراض المعدية، و P30CA125123 معهد السرطان الوطني) “كلية بايلور للطب” الخلوي والخلية الفرز الأساسية.
Materials
| Tissue culture plates according to cell numbers | |||
| 1.5 ml Eppendorf microtubes | Sigma | Z606340-1000EA | |
| 50ml Falcon tubes | Corning | 352070 | |
| Nuclease Free Water – DEPC treated | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2600 | |
| MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| RNAse Zap RNAse Decontamination Solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
| RNA Clean and Concentrator-25 | Zymo | R1017 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 µg | IDT | 1074181 | |
| 40 mm Cell Strainers | VWR | 352340 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | GenDEPOT | CA008-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Regular | Corning | 35010CV | |
| AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns | Miltenyi | ||
| Neon Transfection System Device | ThermoFisher Scientific | ||
| Neon Transfection System 10mL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575020 | For human experiments only |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | 7851 | For human experiments only |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure human | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | For human experiments only |
| Stem Span SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | For human experiments only |
| Recombinant Human SCF | Miltenyi Biotec | 130-096-695 | For human experiments only |
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | For human experiments only |
| Recombinant Human FLT3L | Miltenyi Biotec | 130-096-479 | For human experiments only |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse dissection tools | For mouse experiments only | ||
| Mortar and Pestle | For mouse experiments only | ||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170112 | For mouse experiments only |
| Biotin-conjugated anti c-kit antibody | eBioscience | 13-1171-82 | For mouse experiments only |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | For mouse experiments only |
| X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red | Lonza | 04-418Q | For mouse experiments only |
| Mouse IL-6 | Peprotech | 216-16 | For mouse experiments only |
| Mouse TPO | Peprotech | 315-14 | For mouse experiments only |
| Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | For mouse experiments only |
| Mouse SCF | Peprotech | 250-03 | For mouse experiments only |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sternberg, S. H., Doudna, J. A. Expanding the Biologist’s Toolkit with CRISPR-Cas9. Mol Cell. 58, 568-574 (2015).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32, 941-946 (2014).
- Mandal, P. K., et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell stem cell. 15, 643-652 (2014).
- Gundry, M. C., et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Rep. 17, 1453-1461 (2016).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature methods. 12, 982-988 (2015).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current protocols in immunology. 111, (2015).
- Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 665-677 (2015).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42, e168 (2014).
- Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539, 384-389 (2016).
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Transl Med. 8, 360ra134 (2016).
- Aguirre, A. J., et al. Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting. Cancer Discov. 6, 914-929 (2016).
