Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

1. gün 1: Hücre kültürü Hücreleri istediğiniz miktarı analiz edilecek kültür. Hücre kültür koşulları ve medya soruşturma altında hücre tipleri bağlıdır.Not: ilke olarak, herhangi bir ökaryotik hücre mükellef Kromatin erişilebilirlik FAIRE tarafından analizi için. Bu deneme için bir tek 10 cm tabak (v/v) FBS % 10 ve % 1 ‘ (w/v) penisilin/streptomisin ile desteklenmiş ve %5 CO2 ve 37 ° C için hücreleri % 70-80 izdiham ulaşana kadar 24 saat inkübe DMEM orta numaralı seribaşı 4 x 106 HEK-293T hücreleri (~ 8 x 10 çanak başına 6 hücre). 2. 2. gün: Formaldehit Crosslinking ve hücre hasat Dikkat: Formaldehit çok zehirli ve her zaman bir duman başlık altında kullanılmalıdır. (Eldiven ve önlük) koruyucu giysiler giyin. Atık uygun şekilde atın. Formaldehit son konsantrasyonu % 1 (v/v) (270 µL % 37 (v/v) formaldehit hücre kültür ortamının 10 ml) ulaşmak için bir duman hood hücre kültür ortamda doğrudan ekleyin. Oda sıcaklığında (20-25 ° C) 10 min için kuluçkaya ve tabakları el ile her 2 dakikada öldürdü.Not: Çapraz zaman hücre tipine göre ayarlanabilir. Hücre hatları çoğunluğu için çapraz 10 dakika yeterlidir. Dokular için daha uzun incubations tüm hücreleri fiksasyonu sağlamak için gerekli olabilir. Glisin 0,125 M formaldehit gidermek için son bir konsantrasyon için Ekle (2.5 M glisin stokunun 500 µL kültür orta için 10 mL ekleyin). Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya ve her 2 dakikada öldürdü. 3 hücreleri yıkama x buz soğuk PBS ile (8 g/M NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 g/L KH2PO4, ayarlamak pH HCl ve NaOH 7.4 için). Orta Aspire edin ve PBS 10 mL ekleyerek doğrudan hücre kültür çanak veya şişeye yıka. İki kez gevşek yapışık hücreleri HEK-293T gibi söz konusu olduğunda çok dikkatli olmanın bu adımı yineleyin. PBS çanak tarafına dekolmanı hücrelerin önlemek için dikkatli bir şekilde ekleyin. Üçüncü yıkama sonra buz soğuk PBS ve buz bir 1,5 mL tepki tüp transfer 1 mL hücreye resuspend. Bir hücre kazıyıcı hücreler gerektiğinde ayırmak için kullanın.Not: sınırlı malzeme ile başlatırken, işlem sırasında örnek kaybını önlemek için düşük DNA’ya bağlanıcı tüpler kullanın. Santrifüj vasıl 300 x g soğutmalı masa üstü santrifüj 4 ° C’de 5 min için. Süpernatant dikkatle aspirating tarafından atmak. 3. hücre lizis ve Kromatin parçalanma Hücre Pelet 1 mL FAIRE lizis arabellekte (%1 (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µg/mL leupeptin, 10 µg/mL aprotinin, 2 mM PMSF), resuspend ve dikkatlice yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından hücreleri resuspend. Buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya. Bu aşamada-80 ° C’de örnekleri gerekirse depolar. Çapraz DNA ortalama 200-300 bp boyutuna yamultmak için solüsyon içeren temizleyicide. Sonicator belirli ayarları örnekleri ve kullanılan sonication aygıt her kaynak için belirlenmelidir. Her durumda DNA verimli nın yaşadığı emin olun. DNA kesme için bir en iyi duruma getirme adım adım 5,14 altında açıklanmıştır. Buz üzerinde örnekleri örnek Isıtma önlemek için sonication sırasında serin. Örnek 4 ° C’de 13.000 x g ve 15dk için santrifüj kapasitesi Süpernatant yeni bir tepki tüp aktarın. 100 µL aliquots örneklerinde bölün. -80 ° C’de örnekleri gerekirse depolar.Not: Protokol bu noktada durdurulabilir. 4. de-denetim DNA polietilenin 100 µL adım 3.4 toplam DNA örneği almak için bir başvuru olarak kullanılacak ve crosslink tersine çevirmek için aliquot al. 10 µL RNase-A (10 mg/ml) ekleyin ve 37 ° C’de 1 h için kuluçkaya 10 µL (20 mg/mL), İndinavir K ekleyin. Programlanabilir bir termo blok 4 h 37 ° C’de ve sonra 6 h 65 ° c proteinler ayırmak için ve Glossar tersine çevirmek için kuluçkaya için kullanın. Son olarak, protokol devam etti kadar örnekleri 4 ° C’de tutun ve adım 5’e devam edin.Not: Hangi çapraz başvuru, böylece de crosslinking11ihtiyacını kaldırılması olarak olmamıştır hücrelerden Kromatin örnekleri diğer dürüst iletişim kuralları kullanırlar. Bu örnekler çapraz sonication verimlilik veya DNA istikrar için farklılıklar neden olabilir değildir aslında, bu nedenle test örnekleri olarak aynı işlemi undergone toplam DNA başvuru örnekleri kullanımını daha doğru olur. 5. gün 3: Fenol: kloroform arıtma DNA’ın Sigara-de-çapraz 3.4 adımından aliquot al. 10 µL RNase-A (10 mg/ml) ekleyin ve 37 ° C’de 1 h için kuluçkaya De çapraz aliquot formu adım 5.1 ve 4.2. adımdaki de çapraz örnek almak ve buna paralel olarak devam edin. Son hacmi 300 µL ulaşmak için H2O ekleyin. Fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1) 300 µL bir duman hood ve girdap şiddetle ekleyin.Dikkat: Fenol aşındırıcı ve toksik ve her zaman bir duman başlık altında kullanılmalıdır. (Eldiven ve önlük) koruyucu giysiler giymek, reaksiyon boru sıkıca kapalı ve atık uygun şekilde atın emin olun. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C’de 10 dakika için Dikkatle üst sulu faz, 280 µL yeni bir tepki tüp aktarın. Ayrıca protein içeren Interphase üzerinden herhangi bir enkaz almak emin olun. Kalan alt aşamasını organik çözücü atık olarak atın. 5.3-5,5 adımları yineleyin ve dikkatli bir şekilde yeni bir tepki tüp üst sulu faz 270 µL aktarmak. Kloroform 270 µL bir duman hood ve girdap şiddetle ekleyin.Not: Bu adımı örnekten kalan herhangi bir fenol ortadan kaldırmak için kullanılır. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C’de 10 dakika için Dikkatle üst sulu faz 250 µL herhangi bir enkaz Interphase üzerinden taşımak için değil dikkat çekici bir yeni tepki tüp aktarın. Kalan örnek organik çözücü atık olarak atın. 5 M NaCl 25 µL ve isopropanol 250 µL ekleyin. Glikojen (20 mg/mL) 5 µL DNA taşıyıcı olarak ekleyin. İyi tüpler ters çevirme tarafından mix ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Santrifüj 13.000 x g DNA çökelti 4 ° c de 10 dakika. DNA Pelet 400 µL % 70 (v/v) etanol ile yıkayın. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C’de 10 dakika için Süpernatant dikkatle Aspire edin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuru Pelet izin. 100 µL TE arabellekte (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA) resuspend. De çapraz ücretsiz DNA örneği için 4 h 65 ° C arası DNA Glossar kaldırmak için kuluçkaya. Örnekleri-20 ° C’de depolayın Bir Spektrofotometre kullanarak DNA miktarını ölçmek ve parça boyutu %2 (w/v) özel jel üzerinde kontrol etmek için bir aliquot çalıştırın. Ayarlamak belgili tanımlık kesme zamanı ve yoğunluklarını, Jel Elektroforez 200-300 BP ortalama bir büyüklük elde etmek için özel göre DNA boyutu analiz sonuçları bağlı olarak. 6. ücretsiz Versus toplam DNA kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) tarafından belirlenmesi Nucleosome-ücretsiz DNA (‘aşağıdaki ücretsiz DNA anılacaktır) oranını karşı toplam DNA qRT-PCR17,18tarafından belirlenir. Örnekleri de kantitatif Mikroarray hibridizasyon veya derin sıralama genom çapında belirlemeleri için analiz edilebilir. Tasarım qPCR astar test edilecek bölgeler ve pozitif ve negatif kontrol eder.Not: Uygun olumlu ACTB, GAPDH, TPI1 veya TUBA1A gibi aktif kopya etmek temizlik genlerin organizatörü yer alan astar denetimleridir (β-aktin, GAPDH, TPE veya α-tübülin kodlama). Uygun negatif denetimler heterochromatin bölgeler veya gen çöller bulunur. Diğer uygun negatif denetimleri genomik bölgelerde dinamik olarak düzenlenmiş odağı denetlemek için yerel kopya numarası farklılıklar (Tablo 1) için soruşturma altında bitişik tasarlanabilir. DNA örnekleri 10 ng/µL TE arabelleği ile son bir konsantrasyon için sulandırmak ve seyreltme faktörü son hesaplamalar için dikkate almak (bkz. Adım 6.5). QPCR tepki triplicates iyi başına aşağıdaki reaksiyon karışımı ile bir 96-şey plaka olarak ayarlayın: şablon DNA: 20 ng (2 µL), ileri astar 200 nM (5 mikron stokunun 0.4 µL), ters astar 200 nM (5 mikron stokunun 0.4 µL) , yeşil boya (2 x hisse senedi 5 µL) ve H2O 10 µL için içeren tepki mix kullanmak için ticari bir hazır. Mutlak miktar modunu kullanarak bir gerçek zamanlı qPCR cihazda, çalıştırın ve Ct örneklerinden farklı astar çiftiyle belirlemek. 6.3. adımdaki seyreltme faktörler dikkate alarak toplam DNA örneği almak için aşağıdaki formülü kullanarak her astar için ücretsiz DNA’ın kurtarma oranını hesaplamak:Temsilcisi sonuçları ve bir örnek hesaplama Tablo 2’ de verilmiştir. Örnekleri arasında farklılıklar telafi etmek için olumlu denetim kurtarma oranı için normalize: