JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

При содействии формальдегида изоляции нормативных элементов для измерения доступности хроматина в клетках млекопитающих

Published: April 02, 2018
doi:
10.3791/57272
, , , ,
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS),University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research,Justus-Liebig-University

Summary

Пластичность ядерных архитектуры управляется динамической эпигенетические механизмы, включая некодирующих РНК, ДНК метилирования, нуклеосома репозиционирования а также гистона состав и модификации. Здесь мы описываем Formaldehyde-Assisted изоляции нормативных элементов (ФЭР) протокол, который позволяет определение доступности хроматина воспроизводимость, недорогим и простым способом.

Abstract

Соответствующий ген выражение в ответ на внеклеточные сигналы, то есть ткани линии конкретных и транскрипции гена, критически зависит от весьма определенных государств организации хроматина. Динамический Архитектура ядра контролируется несколькими механизмами и формирует транскрипционный анализ вывода программы. Таким образом, важно определить доступность Локус конкретных хроматина в надежных моды, предпочтительно независимо от антител, которые могут быть источником потенциально накладывающееся экспериментальной изменчивости. Хроматин доступности может быть измерен различными методами, включая assay Formaldehyde-Assisted изоляции нормативных элементов (ФЭР), которые позволяют определение доступности общего хроматина в относительно небольшое количество клеток. Здесь мы описываем FAIRE протокол, который обеспечивает простой, надежной и быстрой идентификации геномной регионов с низким содержанием белка размещение. В этом методе ДНК ковалентно связан с белками хроматина, используя формальдегида в качестве агента сшивки и сдвиговых на мелкие кусочки. Бесплатные ДНК потом обогащаются с помощью извлечение фенола: хлороформ. Соотношение свободной ДНК определяется количественным полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенирования ДНК (ДНК seq) по сравнению с управления образца, представляющие всего ДНК. В регионах с слабее Структура хроматина обогащаются в бесплатный образец ДНК, таким образом позволяя выявления геномной регионов с нижнего уплотнения хроматина.

Introduction

Геномная ДНК эукариотической клетки плотно упакованы в нуклеосом, которые должны быть удалены или перестроен для того, чтобы разрешить взаимодействие других белков с ДНК. Transcriptional активации гена обычно приводит к более открытой конфигурации его nucleosomal структуры, особенно в + 1 нуклеосома1, для облегчения транскрипции РНК-полимеразы. Кроме того нормативные регионов, таких как промоутеров и усилители подвергаются динамичным изменениям в их доступность хроматина, чтобы разрешить взаимодействие с хроматином модификаторы или факторы транскрипции2. Были разработаны несколько подходов для идентификации этих регионов нуклеосома бесплатно. К ним относятся чувствительность к nucleases как DNase I3 или Микрококковая Нуклеаза4, который можно получить доступ только к ДНК когда она не плотно обернута вокруг нуклеосом. Другие методы для идентификации открытых хроматина или бесплатные ДНК включают Транспозаза опосредованной интеграции retrotransposable элементов (проба для доступных Транспозаза хроматина, ATAC)5, или хроматина иммунопреципитации (чип) с помощью антитела против гистонами. FAIRE метод основывается не на фермент способность достичь ДНК или связывание антитела белка, но вместо этого основывается на очистки свободной нуклеосома регионов извлечение фенола: хлороформ6,7. В этом методе ДНК ковалентно связан хроматина белки сшивки агента формальдегида и является стриженый потом на мелкие кусочки, sonication. Плотно упакованных хроматина регионов будет иметь обильные ДНК/белок сшивки, в то время как регионы ДНК с нет или мало нуклеосом будет иметь мало или нет комплексов ДНК/белок высокоструктурированные. Извлечение фенола: хлороформ позволяет очистки не сшитый, бесплатные ДНК в водной фазе, а сшитый ДНК с белками захватывается в фазе органических фенол или водно органических межфазной наряду с белков. Количественная оценка этой свободной ДНК, по сравнению с ссылкой общего образца ДНК позволяет идентифицировать бесплатно регионов хроматина. Фэр метод может использоваться для описания отдельных регионов геномная, как описано здесь, но также подходит для выявления генома общесистемной хроматина доступности при сочетании глубокой последовательности, как описано в различных моделей8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. результаты, полученные Фэр seq и другие методы, такие как ATAC-seq основном накладываются14. Метод Фэр является очень надежной, дешевые и легко выполнять метод для определения свободной нуклеосома регионов. В отличие от других методов он не требует экспериментальных экспериментов для определения надлежащего уровня пищеварения, необходимые для nucleases (DNase-seq, MNase-seq) или transposases (ATAC-seq) и подробно обсуждаются в недавно обзор15. Только параметры корректироваться являются sonication условия и в некоторых случаях время фиксации. Этот документ описывает простой протокол, схематично отображены на рисунке 1 и что не требуется никакого специального оборудования помимо sonicator. Протокол может быть выполнена в разумно короткие сроки и делает FAIRE простой и надежный способ для проверки доступности хроматина в ряде различных типов клеток от легкого клеток11 до начальной клеток, полученных из мыши печень16.

Protocol

1. день 1: Культура клетки Культура клетки, чтобы быть проанализированы на нужную сумму. Условия клетки культуры и средств массовой информации зависят от типов клеток под следствием.Примечание: В принципе, любой эукариотической клетки поддается анализу хроматина доступности FAIRE. Для этого эксперимента, ГЭС 293T 4 х 106 клеток являются семенами в одном 10 см блюдо в среде DMEM дополнена 10% (v/v) FBS и пенициллин/стрептомицина 1% (w/v) и инкубированы на 5% CO2 и 37 ° C в течение 24 ч до тех пор, пока клетки достичь слияния 70-80% (~ 8 x 10 6 клетки за блюдо). 2. день 2: Формальдегид сшивки и уборки клеток Предупреждение: Формальдегид является высокотоксичным и всегда должна использоваться под вытяжного шкафа. Одежда защитная (перчатки и лаборатории пальто). Надлежащим образом утилизируйте отходы. Добавьте формальдегида непосредственно в ячейку культуры среднего в Зонта до конечной концентрации 1% (v/v) (270 мкл формальдегида 37% (v/v) по 10 мл среды культуры клеток). Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре (20-25 ° C) и убил пластины вручную каждые 2 мин.Примечание: Время сшивки может регулироваться в зависимости от типа ячейки. Для большинства из клеточных линий 10 мин сшивки является адекватным. Для тканей больше инкубаций может потребоваться разрешить фиксации всех клеток. Добавить Глицин в конечной концентрации 0,125 м утолить формальдегида (добавить 500 мкл 2,5 М глицин запасов до 10 мл питательной среды). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре и убил каждые 2 мин. Вымыть клетки 3 x с лед холодной PBS (8 г/Л NaCl, 0,2 г/Л хлористого калия, 1,44 г/Л Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 г/Л х2PO4, регулировка рН 7,4 с HCl или NaOH). Аспирационная среднего и мыть непосредственно в ячейку культуры блюдо или колбу путем добавления 10 мл ФСБ. Повторите этот шаг, дважды быть очень осторожным в случае слабо адэрентных клеток, таких как ГЭС 293T. Тщательно добавьте PBS на стороне блюдо во избежание отряд клеток. После третьей стирки Ресуспензируйте клеток в 1 мл, лед холодной PBS и передачи в 1,5 мл трубку реакции на льду. Для отключения клетки при необходимости используйте скребок ячейки.Примечание: При начиная с ограниченным материалом, используйте низкий ДНК связывающих трубы во время процедуры во избежание потери образца. Центрифуги для 5 мин на 300 x g при 4 ° C в охлажденный настольная центрифуга. Отказаться от супернатанта, тщательно аспирационных. 3. сотовый Lysis и фрагментации хроматина Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл FAIRE литического буфера (1% (w/v), 10 мм ЭДТА, мм 50 Tris-HCl рН 8.1, 10 мкг/мл leupeptin, 10 мкг/мл Апротинин, 2 мм PMSF) и Ресуспензируйте клетки путем тщательно закупорить вверх и вниз несколько раз. Проинкубируйте втечение 20 мин на льду. Хранение образцов-80 ° C на этом этапе при необходимости. Sonicate высокоструктурированные ДНК, чтобы наклонить ее средний размер 200-300 ВР. Конкретные параметры sonicator должны быть определены для каждого источника образцов и используется sonication устройства. В любом случае убедитесь, что ДНК эффективно стриженый. Шаг оптимизации для стрижки ДНК описано в шаге 5.14. Прохладный образцы на льду во время sonication избежание нагрева образца. Центрифугуйте образцы для 15 мин и 13 000 x g при 4 ° C. Передача супернатант к новой пробке реакции. Разделение образцы в 100 мкл аликвоты. Хранение образцов-80 ° C, при необходимости.Примечание: Протокол может быть прервано на данный момент. 4. де сшивки управления ДНК Взять 100 мкл аликвота от шаг 3.4 вспять crosslink и использоваться в качестве ссылки для всего ДНК. 10 мкл РНКазы-A (10 мг/мл) и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Добавьте 10 мкл протеиназы K (20 мг/мл). Используйте программируемые термо блок для инкубации за 4 ч при 37 ° C и затем на 6 ч при температуре 65 ° C для расщеплять белки и обращения вспять сшивки. И наконец держать образцы на 4 ° C до возобновления протокол и затем перейдите к шагу 5.Примечание: Другие протоколы FAIRE использовать хроматина образцы из клеток, которые не были высокоструктурированные как ссылка, таким образом отменяющей необходимость де сшивки11. Тот факт, что эти образцы не являются высокоструктурированные может привести к различия в эффективности sonication или стабильности ДНК, поэтому использование всего образцов ДНК, которые подверглись той же процедуре, испытательные образцы является более точным. 5. день 3: Фенол: хлороформ очистка ДНК Принимать не де сшитый аликвота от шага 3.4. 10 мкл РНКазы-A (10 мг/мл) и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Не де сшитый аликвота формы шаг 5.1 и образец де сшитый из шага 4.2 и параллельно. Добавление H2O достичь окончательный объем 300 мкл. Добавьте 300 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта (25:24:1) в зонта и вихревой энергично.Предупреждение: Фенол токсичные и коррозионные и должен использоваться всегда под вытяжного шкафа. Защитная одежда (перчатки и лаборатории пальто), убедитесь, что реакция трубки плотно закрыты и надлежащим образом утилизируйте отходы. Центрифуги для 10 мин на 13 000 x g при 4 ° C. Тщательно передачи 280 мкл верхней водной фазы к новой пробке реакции. Убедитесь в том, чтобы не принимать любой мусор от межфазных, которая также содержит белки. Отменить оставшиеся нижней фазе как органических растворителей отходов. Повторите шаги 5.3-5.5 и тщательно передачи 270 мкл верхней водной фазы к новой пробке реакции. Мкл 270 метилхлороформа в зонта и вихревой энергично.Примечание: Этот шаг используется для устранения любых оставшихся фенола из образца. Центрифуги для 10 мин на 13 000 x g при 4 ° C. Тщательно передать новой трубки реакции, заботясь не проводить любой мусор от интерфаза 250 мкл верхней водной фазе. Отменить оставшиеся образца как органических растворителей отходов. Добавьте 25 мкл 5 М NaCl и 250 мкл изопропанола. 5 мкл гликогена (20 мг/мл), как и перевозчик ДНК. Смесь хорошо, инвертирование трубы и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Центрифуги для 10 мин на 13 000 x g при 4 ° C для ДНК. Помойте лепешка ДНК с 400 мкл 70% (v/v) этанола. Центрифуги для 10 мин на 13 000 x g при 4 ° C. Тщательно удалить супернатант и пусть гранулы сухого 10 мин при комнатной температуре. Ресуспензируйте 100 мкл буфера TE (10 мм трис рН 8, 1 мм ЭДТА). Инкубируйте non де сшитый бесплатные образцы ДНК для 4 ч при температуре 65 ° C для удаления Интер ДНК сшивки. Хранить образцы при-20 ° C. Подсчитать количество ДНК, используя спектрофотометр и запустить Алиготе, чтобы проверить размер фрагментов на геле агарозы 2% (w/v). Отрегулируйте наклон времени и интенсивности, в зависимости от результатов анализа размер дна агарозы электрофорез, чтобы получить средний размер 200-300 ВР геля. 6. Определение свободного по сравнению с всего ДНК путем количественного PCR реального времени (qRT-PCR) Соотношение между нуклеосомой свободной ДНК (в дальнейшем именуемых свободной ДНК) по сравнению с общей ДНК определяется qRT ПЦР17,18. Образцы также могут быть количественно проанализированы microarray гибридизации или глубокую последовательности генома общесистемных определений. Дизайн ПЦР Праймеры для регионов для проверки и для положительной и отрицательной контроля.Примечание: Подходит позитивные элементы, грунты, расположенный в промоутер активно транскрибируется уборки генов, например, ACTB, GAPDH, TPI1 или TUBA1A (кодировка β-актина, GAPDH, TPI или α-тубулина). Соответствующие негативные элементы управления находятся в гетерохроматин регионах или гена пустынь. Другие подходящие негативные элементы управления могут быть разработаны в геномной районах, прилегающих к динамически регулируемых Локус под следствием до управления для локальной копии номер различия (Таблица 1). Развести образцы ДНК до конечной концентрации 10 нг/мкл с TE буфер и учитывать коэффициент разрежения для окончательного расчетов (см. шаг 6.5). Настройка реакции ПЦР в triplicates в 96-луночных пластины, с следующие реакции смесь хорошо: шаблон ДНК: 20 нг (2 мкл), Форвард грунтовка 200 Нм (0.4 мкл акций 5 мкм), обратный грунтовка 200 Нм (0.4 мкл акций 5 мкм) , коммерческого готовые к использованию реакция смеси, содержащие зеленый краситель (5 мкл от 2 x запас) и H2O до 10 мкл. Запустить в режиме реального времени ПЦР устройство, используя режим абсолютной количественной оценки и определить Ct образцов с парами различных грунтовка. Рассчитайте коэффициент восстановления свободной ДНК всего ДНК для каждого праймера, с использованием следующей формулы, принимая во внимание факторы разрежения от шага 6.3:Представитель результаты и пример расчета приведены в таблице 2. Чтобы компенсировать различия между образцами, нормализовать коэффициент восстановления положительный контроль:

Representative Results

Мы использовали метод ФЭР для измерения различий в доступности хроматина MHC класса II генов в клетках HEK293T как опубликованный19. MHC класса II кодирования гены выражены в антиген представляющих клеток (БТР), конститутивно или в ответ на цитокина сигнализации20. Экспрессия генов MHCII управляется комплекс активатор, который связывает конкретные элементы ДНК, называется XY коробки, расположенный в промоутер и усилители эти гены21,22. Это отражается на уровне хроматина, как показал наш FAIRE анализ отдельных регионов в MHC класса II генов HLA-DPB1 и HLA-DMA. Эти эксперименты показали, что хроматина открыт в регионах, охватывающих XY коробки, в то время как он является более компактным, в органах гена (рис. 2). Например, для вычисления, в этой конкретной эксперимента, мы разбавляют общего образца ДНК 10 раз (коэффициент разбавления 10), и бесплатный образец ДНК не был разведен (коэффициент разбавления 1) за qRT-PCR. Cts получены для различных регионов, испытания и расчеты для получения окончательного восстановления коэффициенты и показатели относительной восстановления перечислены в Таблица 2. Эти относительные восстановления соотношения были получены с помощью ACTB промоутер как позитивный элемент управления. Обратите внимание, что эти расчеты для одного из реплицирует, используемый для создания результаты, показанные на рисунке 2. В другом контексте хроматина доступности был испытан в модели для выражения индуцибельной гена. В этом случае были измерены быстрых изменений chromatin уплотнения в ответ на про воспалительных стимул фактор некроза опухоли (ФНО). Клетки HeLa остались необработанные или стимулировали с TNF за 1 ч, после чего ФЭР для измерения хроматина уплотнения на промоутер региона управляющее выражение гена кодирования TNF-отзывчивым цитокина интерлейкина 8 (ИЛ-8). Эти результаты показали доступность сильно увеличенной хроматина в ИЛ 8 промоутер TNF-стимулирует клетки (рис. 3). Доступность на Ил-8 промоутер после стимуляции ФНО даже выше, чем в ACTB промоутер, показаны драматического хроматина, реконструкции в этом регионе регулирования. Как получить коэффициент восстановления в данном случае выше, чем в регионе, в качестве позитивного элемента управления (ACTB промоутер) коэффициент относительной восстановления выше, чем один. Рисунок 1: процесс FAIRE. Клетки являются высокоструктурированные непосредственно в ячейку культуры колбу или блюдо, добавив формальдегида (A). После закалки формальдегида, клетки промывают лед холодной PBS (B) три раза и переданы реакции трубки, где они высокомобильна FAIRE литического буфера и sonicated для сдвига ДНК (C). Один Алиготе извлеченные хроматина является де сшитый нагрев при температуре 65 ° C, чтобы получить ссылку на общее ДНК (D), и впоследствии бесплатные ДНК добывается с использованием фенола: хлороформа из сшитого и де сшитый аликвоты (E). Наконец количественно ДНК, и рассчитывается соотношение бесплатно против всего, что ДНК (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: определение доступности хроматина в гене II MHC класса кластера в клетках HEK293T. HEK293T клетки были проанализированы FAIRE. Соотношение между свободной по сравнению с всего ДНК (т.е., коэффициент относительной восстановления) для промоутер ACTB гена был определен как положительный контроль, гетерохроматин региона 12 Chr. как отрицательный контроль и регулирования регионов и Джин органов МЗ класс II генов HLA-DMA и HLA-DPB1. Верхняя часть показывает схематическое представление локуса и позиции праймеры. Планки погрешностей представляют стандартных отклонений от двух биологических реплицирует измеряется в triplicates. Рисунок был изменен из опубликованного отчета19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: изменения ДНК доступности на Ил 8 промоутер в ответ на лечение ФНО. НеЬа клетки были стимулируется с ФНО (20 нг/мл) для 1 h и анализирует FAIRE. Соотношение между бесплатно против всего, что ДНК был определен для промоутер ACTB (положительный контроль), гетерохроматин региона Chr. 12 (отрицательный контроль) и промоутер ИЛ 8. Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки среднего (SEM) три биологических реплицирует измеряется в дубликаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: Оптимизация условий sonication. Хроматина, извлеченные из клеток 293T был sonified, с помощью целенаправленного sonicator с соответствующим трубы (Таблица материалов). Хроматин был sonicated для указанного времени с повторениями 30 s со следующими параметрами: Пиковая мощность 150, коэффициент 15 циклов в пакетном 500, следуют 30 s: пиковой мощности 2,5, коэффициент 15 циклов в пакетном 500. Результате хроматина был де сшитый, очищенная методом экстракции фенольных: хлороформ и загружаются в 2% агарозном геле. Показано бромид ethidium, окрашенных гель, и позиции молекулярный вес маркеры указаны в ВР. В этом эксперименте оптимальный хроматина размер (200-300 bp) был получен после 20 мин sonication. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Грунтовка Последовательность ACTB-промоутер F AAAGGCAACTTTCGGAACGG ACTB-промоутер R TTCCTCAATCTCGCTCTCGC Chr. 12 отрицательный контроль F ATGGTTGCCACTGGGGATCT Chr. 12 отрицательный контроль R TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA HLA-DMA-XY-Box-F CATCAGTCACTGGGGAGACG HLA-DMA-XY-Box-R GCTTCCCAGCCCAGTTACAT HLA-DMA-5′-F GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA HLA-DMA-5′-R AGCTGCTATGTGTGGTTGGT HLA-DMA-3′-F TGGGGACCTAGTTAGGGAGC HLA-DMA-3′-R AGATCCATGGGAGGAGGCTT HLA-DPB1-XY-Box-F GTCCAATCCCAGGGTCACAG HLA-DPB1-XY-Box-R TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA HLA-DPB1-5′-F GCGTGTTCATGTCTGCATCC HLA-DPB1-5′-R TGATCCTCAGAGCCTGGACA HLA-DPB1-3′-F CCAGCCTAGGGTGAATGTTT HLA-DPB1-3′-R GCCTGGGTAGAAATCCGTCA ИЛ 8 Промоутер F GTGATGACTCAGGTTTGCCCT ИЛ 8 Промоутер R CTTATGGAGTGCTCCGGTGG Таблица 1: Праймеры для ПЦР. Таблица 2: пример вычисления коэффициентов относительного восстановления FAIRE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Фэр является надежной и недорогой метод, позволяющий выявление свободных нуклеосома регионов. Он основан на принципе, что ДНК, обернутые вокруг нуклеосом легко может быть высокоструктурированные гистонов. Извлечение фенола: хлороформ используется для разделения не сшитый и белка свободный фрагменты ДНК от белка прыгните ДНК, которая находится в нижней фазе фенола и в некоторой степени в интерфазе (рис. 1). Таким образом бесплатно нуклеосома регионы перепредставлены в долю свободного ДНК в водной фазе. Ряд публикаций описывают подробные протоколы FAIRE метод23,24,25,26, который может использоваться в дополнение к процедуре, описанной здесь.

Как и другие методы, используемые для определения структуры хроматина, метод FAIRE также критически зависит оптимальный наклон ДНК. Если фрагменты слишком долго, любой нуклеосома свободный регион будет замаскирован прилегающих хроматина прыгните ДНК. Если фрагменты слишком малы, обнаружение ПЦР или глубокую последовательности становится очень трудно. По этой причине, sonication ДНК является важнейшим параметром, который должны быть под контролем и оптимизированы для получения фрагментов вокруг 200-300 длина bp, которые представляют нуклеосом 1-2 (рис. 4).

Другой параметр, который может повлиять на окончательный результат является сшивки образца. Хотя описанную здесь процедуру фиксации действителен для большинства клеточных линий, исследователь должен тщательно оценить этот шаг для конкретного образца исследуемого, особенно при использовании тканей, где больше времени фиксации может быть необходимо позволить Формальдегид достигают клеток в образце ткани.

В отличие от других методов, таких как DNase I или Микрококковая Нуклеаза Гиперчувствительность, чип или ATAC, FAIRE не полагаться на ферментативную активность или специфические антитела, и поэтому он не нуждается в титрования или оптимизации условий реакции. Это делает FAIRE идеальный метод для измерения хроматина доступность для лабораторий с небольшим опытом работы в области хроматина. Кроме того, экспериментальные экспериментов требуются только для того чтобы оптимизировать шаг сдвига ДНК и сшивки время, когда это необходимо.

Этот метод был первоначально разработан в дрожжи6, но он также был продлен в mammalian клетках. ДНК, очищенная с помощью метода FAIRE может использоваться для глубокого виртуализации, позволяя генома общесистемной характеристика состояние хроматина. Это уже доказано полезным в ряде исследований8,9,10,11,12,13,19,27, 28.

Результаты от FAIRE-seq эксперименты показывают большие совпадения с результатами, полученными другими методами, такими как DNase-seq14, хотя некоторые различия возникают. Это из-за методологических различий, как, например, что расслабленной или перестроенный нуклеосом могут по-прежнему препятствуют расщепления, DNase, хотя эти регионы ДНК будет меньше подвержен производят ДНК/белок сшивки и таким образом будет определяться как нуклеосома бесплатный регионы с помощью FAIRE9. Кроме того присутствие гистоны как РНК полимеразы или читатель белков для эпигенетических меток может привести к ДНК/белок сшивки и таким образом будет интерпретироваться как белка Упакованные регионов в экспериментах FAIRE. Такие ограничения присущи каждый метод, используемый для определения состояния хроматина, повышая тем самым необходимость использовать сочетание различных методов, чтобы получить всеобъемлющее представление о.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Тилмана Borggrefe (Университет Гиссен) любезно обмена sonication устройство. Работа с M.L.S. поддерживается грантов от Deutsche Forschungsgemeinschaft (ШМЁГНЕР 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, совершенство кластера сердечно-легочной системы (EXC 147/2, ECCPS), Deutsche Krebshilfe (111447) и программу IMPRS-HLR Максимум Planck общества.

Materials

Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Carl Roth A156.1
Glycogen, 20 mg/ml Thermo Fisher R0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox Thermo Fisher AB1162B
Proteinase K, 20 mg/ml Thermo Fisher EO0491
RNase A, 10 mg/ml Thermo Fisher EN0531
Leupeptin Sigma L8511
Aprotinin Sigma A1603
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma 78830
milliTUBE 1 ml AFA Fiber Covaris 520130
Holder milliTUBE 1ml Covaris 500371
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosistems 4376600
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. Wu, C. The 5′ ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994 (2015).
  15. Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28 (2016).
  17. Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455 (2014).
  18. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50 (2013).
  19. Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547 (2017).
  20. Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Ting, J. P. -. Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , (2013).
  26. Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660 (2017).
  28. Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

Tags

Chromatin AccessibilityFormaldehyde-assisted IsolationRegulatory ElementsMammalian CellsDNA-protein Cross-linkingChromatin RemodelingFAIRESonicationChromatin Fragmentation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rodríguez-Gil, A., Riedlinger, T., Ritter, O., Saul, V. V., Schmitz, M. L. Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57272, doi:10.3791/57272 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image