哺乳類細胞におけるメジャー クロマチン アクセシビリティ規制要素のホルムアルデヒドによる分離

1. 1 日目: 細胞培養 希望の金額を分析対象とする細胞を培養します。培養条件とメディアは、調査の下で細胞の種類によって異なります。注: 原則として、すべての真核細胞は放任でクロマチン接近性の分析に従う義務があります。この実験のため 4 × 106 HEK 293 t 細胞は 10% (v/v) FBS と 1% (w/v) ペニシリン/ストレプトマイシン、補われ、5% CO2と 24 h、電池が 70-80% の合流点に達するまでの 37 ° C で培養した DMEM 培地で 1 つの 10 cm 皿に播かれる (~ 8 x 106セル一皿とする)。 2. 2 日目: 架橋結合するホルムアルデヒドとセルを収穫 注意: ホルムアルデヒドは非常に有毒、ヒューム フードの下で常に使用する必要があります。(手袋、白衣) 防護服を着用します。廃棄物を適切に破棄します。 発煙のフード 1% (v/v) (細胞培養培地 10 mL に 37% (v/v) ホルムアルデヒドの 270 μ L) の最終濃度に到達する細胞培養液に直接ホルムアルデヒドを追加します。室温 (20-25 ° C) で 10 分間インキュベートし、2 分ごと手動でプレートをスルーします。メモ: 架橋時間は、細胞の種類に応じて調整できます。細胞の大半、架橋の 10 分は十分です。組織のすべてのセルの固定できるように長い孵化を必要があります。 ホルムアルデヒドをクエンチする 0.125 M の最終的な集中にグリシンを追加 (培地 10 mL に 2.5 M グリシン株式 500 μ L を追加)。室温で 5 分間インキュベートし、2 分ごとをスルーします。 洗浄セル 3 x 氷冷 PBS (8 g/L の NaCl、KCl、1.44 g/L の Na2HPO4 · 2 H2O、0.24 g/L KH2PO4、0.2 g/L は、7.4 塩酸または水酸化ナトリウムで pH を調整する)。培地を吸引し、10 mL の PBS を追加することによって細胞培養ディッシュやフラスコで直接洗ってください。2 回 HEK 293 t など緩く付着細胞の場合非常に注意してこの手順を繰り返します。細胞の剥離を避けるために、お皿の横に慎重に PBS を追加します。 第 3 洗浄後氷冷 PBS と氷の上の 1.5 mL の反応管への転送の 1 mL の細胞を再懸濁します。必要に応じてセルをデタッチするのに細胞スクレーパーを使用します。注: 限られた材料とを開始するときは、処理中にサンプルの損失を避けるために低の DNA 結合管を使用します。 4 ° c 冷却卓上遠心機で 300 × g で 5 分間遠心します。上清を破棄するには、慎重にそれを吸引します。 3. 細胞換散およびクロマチンの断片化 1 mL FAIRE 換散バッファー (1% (w/v)、10 ミリメートルの EDTA、50 mM トリス塩酸 pH 8.1 10 μ G/ml leupeptin、10 μ G/ml アプロチニン、2 mM PMSF) で細胞ペレットを再懸濁します、慎重を上下に数回ピペッティングにより細胞を再懸濁します。氷の上に 20 分間インキュベートします。必要な場合は、この手順で-80 ° C でサンプルを格納します。 超音波照射架橋 200 300 bp の平均サイズにせん断する DNAサンプルと使用される超音波デバイスの各ソースに対して、超音波発生装置の特定の設定を決定する必要があります。いずれの場合も、DNA、効率的に剪断するを確認します。DNA のせん断の最適化手順については [ステップ 5.14 説明します。サンプルの加熱を避けるために超音波処理中に氷のサンプルを冷却します。 15 分と 4 ° C で 13,000 x g のサンプルを遠心分離します。 新しい反応チューブに上清を転送します。100 μ L の因数でサンプルを分割します。必要な場合は、-80 ° c のサンプルを格納します。注: プロトコルをこの時点で中断できます。 4. デ架橋コントロール DNA の 100 μ L を分注ステップ 3.4 クロスリンクを逆にして総 DNA のための参照として使用するから取る。RNase A (10 mg/mL) の 10 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート プロティナーゼ K の 10 μ L (20 mg/mL) を追加します。37 ° C で 4 時間放置、蛋白質を切断し、逆にクロスリンク 65 ° C で 6 h をインキュベートするプログラム可能なサーモ ブロックを使用します。最後に、プロトコルが再開されるまで、4 ° C でサンプルを保持し、ステップ 5 に進みます。注: 他のフェア プロトコルは、参照、したがってデ架橋11の必要性を廃止として架橋されていない細胞からクロマチン サンプルを使用します。これらのサンプルは架橋は、超音波処理効率や DNA の安定性の違いにつながる可能性という事実、したがってテスト サンプルと同じ手順を受けている合計の DNA 試料の使用はより正確です。 5 日 3:: クロロホルム DNA 精製 ステップ 3.4 から分注非・ デ ・架橋を取る。RNase A (10 mg/mL) の 10 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート 非・ デ ・架橋因数フォーム ステップ 5.1 と 4.2 のステップからデ架橋サンプルを取るし、平行に進みます。H2O 300 μ L の最終巻に到達するを追加します。 ヒューム フードと渦に精力的にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) の 300 μ L を追加します。注意: フェノール腐食性、有毒、ヒューム フードの下で常に使用する必要があります。(手袋、白衣) 防護服を着用、反応管、密閉し、廃棄物の適切なかどうかを確認します。 4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心 慎重に上部の水相の 280 μ L を新しい反応管に転送します。また蛋白質を含む中間期からの残骸を取らないことを確認します。有機溶剤廃棄物として残り下相を破棄します。 手順 5.5 5.3 し慎重に上層の水相の 270 μ L を新しい反応管に転送します。 ヒューム フードと渦に精力的に 270 μ L のクロロホルムを追加します。注: この手順は、サンプルから残りのフェノールを除去するために使用されます。 4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心 慎重に上部の水相の 250 μ L を新しい反応管、中間期からの残骸を運ぶように世話に転送します。有機溶剤廃棄物として残りのサンプルを破棄します。 5 M の NaCl を 25 μ l 添加し、250 μ L のイソプロパノールを追加します。DNA キャリアとしてグリコーゲン (20 mg/mL) の 5 μ L を追加します。チューブを反転でよく混ぜるし、室温で 20 分間インキュベートします。DNA の沈殿物に 4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心します。 70% (v/v) エタノール 400 μ L で DNA の餌を洗います。4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心 慎重に上清を吸引し、室温で 10 分間乾燥ペレット。100 μ L TE バッファー (10 mM Tris pH 8、1 mM EDTA) に再懸濁します。 間 DNA クロスリンクを削除する 65 ° C で 4 時間以外・ デ ・架橋無料 DNA サンプルをインキュベートします。-20 ° C で試料を保存します。 分光光度計を用いた DNA の量を定量化し、2% (w/v) agarose のゲルのフラグメント サイズをチェックする因数を実行します。アガロースによる DNA サイズの分析結果に応じたゲルの電気泳動、200-300 bp の平均サイズを求める、剪断の時間と強度を調整します。 6. 量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) による無料の対総 DNA の定量 (次の自由な DNA と呼ばれる) で無料のヌクレオソーム DNA の比率に対して DNA が qRT PCR17,18によって決定されます。マイクロ アレイの交配またはゲノム決定のディープ シーケンスごとに、サンプルを定量的分析もできます。 正と負のコントロール、テストする領域の qPCR のプライマーを設計します。注: 適切な肯定的な制御は、ACTB、GAPDH、TPI1、TUBA1A など活発に転写されるハウスキーピング遺伝子のプロモーターであるプライマー (β-アクチン、GAPDH、TPI など α-チューブリンのエンコーディング)。適切なネガティブ コントロールは、ヘテロクロマチン領域または遺伝子砂漠で発見されます。その他の適切な負の制御はローカル コピー番号違い (表 1) を制御するための調査の下で動的に調整された軌跡に隣接するゲノム領域で設計できます。 TE バッファーと 10 ng/μ L の最終的な集中に DNA のサンプルを希釈し、最終的な計算の希釈倍率を考慮 (6.5 の手順を参照してください)。 96 ウェルのプレートは、ウェルあたり次の反作用の組合せでトリプリケートの qPCR 反応を設定: テンプレート DNA: 20 ng (2 μ L) があり、前方プライマー 200 nM (5 μ M 証券の 0.4 μ L)、逆プライマー 200 nM (5 μ M 証券の 0.4 μ L)、緑の染料 (2 x の在庫から 5 μ L)、および H2O 10 μ L を含む反応混合物を使用する商業準備。 絶対定量モードを使用して実質の時間の qPCR のデバイスで実行し、異なるプライマー対を持つサンプルの Ct を決定します。自由な DNA の回復ステップ 6.3 から希釈倍率を考慮して次の数式を使用して各プライマーの総 DNA の比率を計算します。表 2に代表的な結果と、計算の例を与えられています。 サンプル間の違いを補うために肯定的な制御の回収率に正常化します。