ساعد فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية لتدبير الكروماتين الوصول في خلايا الثدييات
Summary
ويسيطر اللدونة للهندسة النووية آليات جينية الديناميكية بما في ذلك الترميز غير الكشف الحمض النووي مثلايشن وإعادة تموضع nucleosome، فضلا عن تكوين هيستون والتعديل. هنا يمكننا وصف بروتوكول عزل فورمالديهيدياسيستيد من عناصر تنظيمية (العملية) الذي يتيح تحديد الوصول الكروماتين في طريقة استنساخه وغير مكلفة وبسيطة.
Abstract
التعبير الجيني المناسب استجابة لإشارات خارج الخلية، هو النسخ الجينات الخاصة بالانسجة والنسب، تعتمد اعتماداً حاسما على دول محددة بدرجة عالية من منظمة الكروماتين. بنية النواة دينامية يتم التحكم بواسطة آليات متعددة والأشكال برامج الإنتاج النسخي. ولذلك، من المهم تحديد الوصول الكروماتين موقعا على حدة بطريقة موثوقة التي يفضل أن تكون مستقلة من الأجسام المضادة، التي يمكن أن تكون مصدر التباس يحتمل أن تقلب التجريبية. ويمكن قياس إمكانية الوصول الكروماتين بأساليب مختلفة، بما في ذلك فحص العزل فورمالديهيدياسيستيد من العناصر التنظيمية (العملية)، التي تسمح تحديد إمكانية الوصول العام الكروماتين في عدد قليل نسبيا من الخلايا. هنا يصف لنا فير بروتوكول يسمح لتحديد مناطق الجينوم مع شغل بروتين منخفض بسيطة وموثوق بها وسريعة. في هذا الأسلوب، منضمة إلى البروتينات الكروماتين استخدام فورمالدهايد كعامل crosslinking تساهمي الحمض النووي والمنفصمة إلى قطع صغيرة. بعد ذلك إثراء الحمض النووي مجاناً باستخدام الفينول: كلوروفورم الاستخراج. نسبة الحمض الحر يتحدد بكمية البلمرة المتسلسل (qPCR) أو تسلسل الحمض النووي (DNA-seq) مقارنة بعينه السيطرة تمثل مجموع الحمض النووي. يتم إثراء المناطق بهيكل أكثر مرونة من الكروماتين في عينة الحمض النووي مجاناً، مما يسمح بتحديد مناطق الجينوم مع انخفاض الضغط الكروماتين.
Introduction
هي معبأة بأحكام الحمض النووي للخلايا حقيقية النواة في نوكليوسوميس، الذي يحتاج إلى إزالة أو تشكيلها من أجل السماح بالتفاعل بين البروتينات الأخرى مع الحمض النووي. النسخي تنشيط الجين عادة ما يؤدي إلى تكوين أكثر انفتاحاً لهيكل نوكليوسومال، لا سيما في نوكليوسومي + 11، تيسيرا للنسخ بالحمض النووي الريبي بوليميراز. أيضا، المناطق التنظيمية مثل المروجين والقدرة على تغيرات دينامية في إمكانية الوصول الكروماتين للسماح بالتفاعل مع المعدلات الكروماتين أو عوامل النسخ2. وضعت عدة نهج لتحديد هذه المناطق خالية من نوكليوسومي. وتشمل هذه الحساسية إلى نوكليسيس مثل الدناز أنا3 أو نوكلاس ميكروكوككال4، الذي يمكن الوصول إليه فقط الحمض النووي عند غير محكم التفاف حول نوكليوسوميس. وتشمل أساليب أخرى للتعرف على الكروماتين مفتوحة أو الحمض الحر إدماج عناصر ريتروترانسبوسابل (مقايسة للوصول ترانسبوساسي “الكروماتين”، أتاك) ترانسبوساسي بوساطة5، أو باستخدام إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) الكروماتين أجسام مضادة ضد هيستونيس. أسلوب عدم التدخل لا يستند إلى قدرة إنزيم للوصول إلى الحمض النووي أو الربط من جسم مضاد لبروتين معين، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على تطهير المناطق الحرة نوكليوسومي من6،استخراج كلوروفورم فينول:7. في هذا الأسلوب، الحمض النووي تساهمي ملزمة للبروتينات الكروماتين فورمالدهايد عامل crosslinking والمنفصمة بعد ذلك إلى قطع صغيرة قبل sonication. وسيكون مناطق الكروماتين محكم معبأة وفرة الحمض النووي/البروتين كروسلينكس، بينما المناطق الحمض النووي مع نوكليوسوميس لا يوجد أو قليل سوف يكون قليلاً أو لا كروسلينكيد الحمض النووي/البروتين المجمعات. يسمح استخراج فينول: كلوروفورم تنقية كروسلينكيد-الحمض النووي مجاناً في المرحلة المائية، بينما كروسلينكيد الحمض النووي للبروتينات يتم التقاطها في المرحلة الفينول العضوية أو في الطور البيني مائي العضوية إلى جانب البروتينات. التحديد الكمي لهذا الحمض الحر مقارنة بإشارة من مجموع عينة الحمض النووي يسمح تحديد المناطق الحرة الكروماتين. الأسلوب فير يمكن استخدامها لتوصيف مناطق الجينوم الفردية كما هو موضح هنا، بل هو أيضا مناسبة للتعرف على إمكانية الوصول على نطاق الجينوم الكروماتين عندما يقترن بتسلسل العميق كما هو موضح في نماذج مختلفة8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-النتائج التي حصل عليها فير-seq وأساليب أخرى مثل seq أتاك هي متداخلة إلى حد كبير14. أسلوب عدم التدخل قوية جداً ورخيصة وسهلة لتنفيذ أسلوب لتحديد مناطق خالية من نوكليوسومي. خلافا لأساليب أخرى، أنها لا تتطلب تجارب رائدة لتحديد المستوى المناسب الهضم كما هو مطلوب ل nucleases (الدناز seq، seq منسى) أو ترانسبوساسيس (أتاك-seq) ونوقشت بالتفصيل في استعراض الأخيرة15. المعلمات فقط تعديلها هي سونيكيشن الشروط وفي بعض الحالات وقت التثبيت. وتصف هذه الورقة بروتوكولا مباشرة تخطيطياً المعروض في الشكل 1 ، والذي لا يتطلب أي معدات خاصة خلاف سونيكاتور. البروتوكول يمكن القيام بها في فترة زمنية قصيرة نسبيا ويجعل فير طريقة سهلة ويمكن الاعتماد عليها اختبار إمكانية الوصول الكروماتين في عدد من أنواع الخلايا المختلفة بدءاً من خلايا الرئة11 الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من كبد الفأر16.
Protocol
Representative Results
Discussion
فير وسيلة قوية وغير مكلفة يسمح بتحديد مناطق خالية من نوكليوسومي. ويستند على مبدأ أن الحمض النووي الملتفة حول nucleosomes يمكن بسهولة كروسلينكيد إلى هيستونيس. استخراج كلوروفورم فينول: يستخدم لفصل غير كروسلينكيد وخالية من البروتين شظايا من الحمض النووي من البروتين-ربط الحمض النووي، الذي تم العثور عليه في مرحلة الفينول أقل، وإلى حد ما في الطور البيني (الشكل 1). ولذلك، مناطق خالية من نوكليوسومي مفرطاً في جزء صغير من الحمض النووي مجاناً في مرحلة مائي. وصف عدد من المنشورات بروتوكولات مفصلة فير الأسلوب23،24،25،26، التي يمكن الرجوع إليها لاستكمال الإجراء الموضح هنا.
مماثلة لسائر الأساليب المستخدمة لتحديد هيكل الكروماتين، يعتمد الأسلوب فير أيضا حاسمة على القص المثلى من الحمض النووي. إذا كانت الأجزاء طويل جداً، سيتم حجب أي منطقة خالية من نوكليوسومي بالحمض النووي المرتبطة الكروماتين المجاورة. إذا كانت الشظايا صغيرة جداً، يصبح من الصعب جداً الكشف بواسطة qPCR أو تسلسل عميق. ولهذا السبب، سونيكيشن من الحمض النووي هو معلمة حاسمة يجب أن تسيطر والأمثل من أجل الحصول على أجزاء حول طول 200-300 شركة بريتيش بتروليوم، التي تمثل 1-2 نوكليوسوميس (الشكل 4).
معلمة أخرى يمكن أن تؤثر على النتيجة النهائية هو كروسلينكينج عينة. على الرغم من أن الإجراء التثبيت الموضحة هنا صالحة لمعظم خطوط الخلايا، الباحث يجب أن تقيم بعناية هذه الخطوة للحصول على نموذج خاص قيد الدراسة، خاصة عند استخدام الأنسجة، حيث قد يكون من الضروري السماح لأوقات أطول في التثبيت فورمالدهايد للوصول إلى الخلايا في كل عينة الأنسجة.
على عكس الأساليب الأخرى، مثل الدناز أنا أو فرط نوكلاس ميكروكوككال أو شرائح، أو أتاك، فير لا تعتمد على نشاط الأنزيمي أو أجسام مضادة محددة، ولذلك فإنه لا حاجة المعايرة أو تحسين شروط رد فعل. وهذا يجعل فير طريقة مثالية لقياس إمكانية الوصول الكروماتين لمختبرات مع خبرة قليلة في مجال الكروماتين. وباﻹضافة إلى ذلك، تجارب رائدة مطلوبة فقط من أجل تحسين الخطوة قص الحمض النووي، وفي الوقت كروسلينكينج، عند الضرورة.
الطريقة التي وضعت في البداية في الخميرة6، بل أنها امتدت أيضا إلى خلايا الثدييات. يمكن استخدام الحمض النووي تنقيته باستخدام أسلوب عدم التدخل لتسلسل العميق، السماح لتوصيف حالة الكروماتين على نطاق الجينوم. وهذا الفعل قد أثبتت أنها مفيدة في عدد من الدراسات8،9،10،11،،من1213،،من1927، 28.
إظهار النتائج من التجارب فير-seq تداخل كبير مع النتائج التي تم الحصول عليها بطرق أخرى مثل الدناز-seq14، على الرغم من أن تنشأ بعض الاختلافات. هذا هو سبب الاختلافات المنهجية على سبيل المثال يمكن أن لا تزال تعيق nucleosomes استرخاء أو تشكيلها الانقسام ومن الدناز الأول، بينما هذه المناطق الحمض النووي سوف تكون أقل عرضه لإنتاج كروسلينكس الحمض النووي/البروتين وهكذا سوف يتحدد حسب خالية من نوكليوسومي المناطق باستخدام فير9. أيضا، وجود بروتينات غير هيستون مثل رنا بولمرس أو القارئ البروتينات لعلامات جينية يمكن أن يسفر عن كروسلينكس الحمض النووي/البروتين وهكذا سوف تفسر على أنها مناطق معبأة البروتين في التجارب فير. وهذه القيود الملازمة لكل أسلوب يستخدم لتحديد الدولة الكروماتين، مما يزيد الحاجة إلى استخدام مزيج من أساليب مختلفة للحصول على نظرة شاملة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر تيلمان بورجريفي (جامعة جيسين) يرجى تقاسم الجهاز sonication. دعم العمل من M.L.S. من المنح المقدمة من الأوقيانوغرافية ألماني (شم 1417/8-3)، SFB/TRR81، SFB1021، SFB1213، والتميز الكتلة نظام القلب والرئتين (اككبس، EXC 147/2)، Deutsche كريبشيلفي (111447) والبرنامج إيمبرس-HLR جمعية ماكس بلانك.
Materials
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Carl Roth | A156.1 | |
| Glycogen, 20 mg/ml | Thermo Fisher | R0561 | |
| ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox | Thermo Fisher | AB1162B | |
| Proteinase K, 20 mg/ml | Thermo Fisher | EO0491 | |
| RNase A, 10 mg/ml | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511 | |
| Aprotinin | Sigma | A1603 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830 | |
| milliTUBE 1 ml AFA Fiber | Covaris | 520130 | |
| Holder milliTUBE 1ml | Covaris | 500371 | |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | ||
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosistems | 4376600 |
References
- Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Wu, C. The 5′ ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
- Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
- Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
- Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
- Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
- Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
- Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
- Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994 (2015).
- Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28 (2016).
- Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455 (2014).
- Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50 (2013).
- Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547 (2017).
- Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
- Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
- Ting, J. P. -. Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
- Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , (2013).
- Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
- Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660 (2017).
- Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).
